Розділ 2.8, стор. 47). Фермент зберігали при температурі 4оС у 0,05 мМ
Na-фосфатному буфері, рН=7,0 [217].
2.6. Іммобілізація галактозооксидази на аміноорганокремнеземі
Проведено сорбцію галактозооксидази на аміноорганокремнеземі. Для іммобілізації
галактозооксидази на аміноорганокремнеземі готували розчин ферменту (80-120
міжнародних одиниць активності у 50 мл) на 1 г носія у 0,05 М Na-фосфатному
буфері, рН=7,0. Носій додавали в розчин ферменту і інкубували при кімнатній
температурі на протязі 2 год. Відмивку від незв’язаного ферменту проводили 0,05
М Nа-фосфатним буфером (рН=7,0). Ступінь відмивки контролювали
спектрофотометрично (l=280 нм). Фермент зберігали при температурі 4оС в 0,05 М
Nа-фосфатному буфері, рН=7,0 [218].
2.7. Одержання галактозооксидази, іммобілізованої на аміноорганокремнеземі,
активованому продуктом ферментативного окиснення галактози
Для одержання іммобілізованого препарату таким методом готували 50 мл розчину
галактозооксидази (80-120 міжнародних одиниць активності ферменту в 0,05 М
Nа?фосфатному буфері, рН=7,0) і 50 мл розчину, який містить 0,9-2,88 г
галактози в 0,05 м Nа-фосфатному буфері (рН=7,0) на 1 г носія. Носій додавали в
розчин ферменту, туди ж додавали розчин субстрату і інкубували при кімнатній
температурі на протязі 2 год. Відмивку проводили 0,05 м Nа-фосфатним буфером,
рН=7,0. Ступінь відмивки контролювали спектрофотометрично (l=280 нм). Фермент,
що був іммобілізований на аміноорганокремнеземі, активованому
2,4-галактогексодіальдозою, зберігали при температурі 4оС (рис. 2.5). При
окисненні галактози галактозооксидазою утворюється диальдегід, який може бути
використано для іммобілізації ферменту ( як багатофункціональний реагент).
Рис. 2.5. Схема одержання 2,4–галактогексодіальдози і іммобілізація
галактозооксидази на поверхні амінокремнезему за допомогою продукту
ферментативної реакції.
2.8. Іммобілізація галактозооксидази на аміновмісних носіях, активованих
2,4-толуілендіізоціанатом і хлорангідридом ціанурової кислоти
До 1 г відповідного носія додавали 50 мл розчину ферменту в 0,05 м
Nа-фосфат-ному буфері (рН=7,0) і зтрушували на протязі 2 год. Після того носій
з іммобілізованим ферментом відмивали тим же буфером. Ступінь відмивки
контролювали спектрофотометрично (l=280 нм). Визначення активності одержаного
препарату іммобілізованої галактозооксидази описано нижче. Одержаний фермент
зберігали при температурі 4оС у 0,05 м Nа-фосфатному буфері (рН=7,0) [219].
Рис. 2.6. Схема активації аміноорганокремнезему 2,4 – толуілендіізоціанатом та
наступної іммобілізації галактозооксидази.
Рис. 2.7. Схема активації аміноорганокремнезему хлорангідридом ціанурової
кислоти та наступної іммобілізації галактозооксидази.
2.9. Визначення швидкості реакції окиснення галактози галактозооксидазою [219]
Галактозооксидазу використовували у вигляді розчинів і ліофільно висушеного
порошку [220]. Як вже відмічалося, галактозооксидаза каталізує окиснення
D?галактози у положенні С-6 за участю молекулярного кисню:
Активність препаратів розраховували по швидкості поглинання кисню, визначеної
за допомогою електрода Кларка. Для цього в термостатовану при 25оС ємність з
кисневим електродом, яка містить 5,5 мл 100 мМ розчину галактози у 0,05 м
фосфатному буфері (рН=7,0), вносили 0,5 м розчину ферменту і реєстрували на
стрічці самописцю за допомогою полярографа 4LР7е (ЧРСР) кінетику поглинання
кисню. З початкової ділянки кінетичної кривої по її нахилу визначали швидкість
ферментативної реакції (1 одиниця активності відповідає кількості фермента, що
каталізує окиснення 1 мкмоль субстрату за 1 хв. М. од.). При розрахунках
концентрацію кисню (So) приймали рівною 0,253 мM [221]. Активність розчину
галактозооксидази складала 1-4 од./мл, активність ліофільно висушеного порошку
– 0,01 од./мг.
Активність іммобілізованої галактозооксидази визначали у протоковому режимі.
Для цього в колонку розміром 4Ч2,5 мм завантажували іммобілізований препарат і
прокачували насосом буферний розчин зі швидкістю 2 мл/хв. На виході колонки
вмонтовано кран-дозатор петльового типу, що дозволяє вводити у потік буфера
розчин субстрату (50 мкл), на виході – протоковий кисневий електрод.
Вимірювання активності проводили за допомогою імпульсного вводу субстрату і
шляхом безперервного його пропускання через колонку. В першому випадку
поглинання О2 записується самописцем у вигляді піку, а в другому – реєструється
стаціонарна концентрація О2 на виході з колонки.
При неперервному пропусканні субстрату через колонку розраховували активність
іммобілізованого препарату, приймаючи, що швидкість поглинання кисню описується
рівнянням першого порядку (So<
приймає вигляд: ,
де: – ступінь конверсії кисню при проходженні через колонку розчину вуглеводу;
So – початкова концентрація кисню;
St – концентрація кисню на виході колонки;
– максимальна швидкість ферментативної реакції, уявна;
Km– константа Міхаеліса, уявна;
m/V – час контакту субстрату з іммобілізованим ферментом,
m – маса іммобілізованого ферменту;
V – швидкість протікання буферу;
– константа швидкості поглинання кисню, уявна.
Активність (А) іммобілізованої галактозооксидази дорівнює: . Вона була у межах
2-7 од. на 100 мг.
2.10 Дослідження впливу ферріціаніду калію на активність розчинної
галактозооксидази
Вплив ферріціаніду калію вивчали в границях концентрацій від 10-7 м/л до 5.10-2
м/л. Для вивчення впливу ферріціаніду калію на активність розчинної
галактозооксидази готували Na-фосфатний буферний розчин (рН=7,0), який містив
відповідну кількість фе
- Київ+380960830922