Раздел 2.
Методы исследования и материалы
2.1.Использованные препараты
Производное актиноцинового ряда актиноцил-бис-(диметиламиноэтил) амин (Act II)
с двумя метиленовыми группами в боковых цепях хромофора (рис. 2.1) был
синтезирован Глибиным и др. [163] и использовался без дополнительной очистки.
R1=R2=
Рис. 2.1. Структурная формула производного актиноцина Act II.
В работе были использованы коммерческая ДНК из тимуса теленка фирмы “Serva”(42%
GC, ДНКthym.), ДНК из Micrococcus lysodeilcticus (76% GC, ДНКМ. lys) и ДНК из
Clostridium perfringens (28% GC, ДНКCl. perf.) фирмы "Sigma",
полифосфат (ПФ) фирмы “Serva”, представляющий собой полианион, состоящий из
остатков фосфорной кислоты (рис.2.2).
Рис.2.2. Структурная формула ПФ.
Все исследования кривых титрования смесей Act II - ДНК и Act II – ПФ
проводились в фосфатном буферном растворе (2,5ґ10-3 M KH2PO4, 2,5ґ10-3 M
Na2HPO4, pH=6,86) с общей концентрацией ионов Na+ в интервале (0,02 - 0,15 М)
при температуре 22°С.
Биологически активный нуклеозид 6-азацитидин (6AZC) (рис.2.3), был синтезирован
в Институте молекулярной биологии и генетики НАН Украины, г. Киев, и
использовался нами без дополнительной очистки.
Рис. 2.3. Структурная формула 6AZC.
Образцы ДНК, которые использовались при изучении комплексообразования с 6AZC,
были выделены из эпидидимуса семенников самцов (ДНКepid) крыс популяции Вистар
контрольных животных и животных, которые подвергались хроническому внутреннему
радиационному воздействию в малых дозах в условиях зоны отчуждения
Чернобыльской АЭС. Животные в течение 12 месяцев получали корм и питьевую воду,
загрязненную радионуклидами, характерными для Чернобыльского аварийного выброса
(в основном, Cs134+137 и Sr90). Фоновое внешнее облучение составляло 40-60
мкР/час. Суммарные поглощенные дозы (ПД) на гонады крыс составили 57 сГр
(расчет доз проведен в Институте экспериментальной онкологии и радиобиологии
им. Кавецкого, г. Киев). Контролем служили животные той же популяции и
возраста, которые получали чистый корм в виварии г. Киева. Выделение ДНК (пул
от 5-6 животных) проводили стандартным детергентным методом [170]. Количество
примесей белка и РНК в образцах составило менее 1%. Средняя молекулярная масса
всех выделенных препаратов ДНК составила 25-30 МДа, а величины гиперхромных
эффектов находились в интервале (38-40) % [171].
Все исследования смесей 6AZC - ДНКepid проводились в 0,01SSC (1SSC - 0,15 M
NaCl + 0,015 M цитрат Na, pH 7,2) буферном растворе при температуре 22°С.
Модельные образцы "деградированной" ДНК с поврежденной структурой готовили на
основе частично денатурированных – ренатурированных молекул ДНК следующим
образом: фиксируемые объемы бидистиллированной воды добавляли к точным объемам
концентрированного водного раствора тимусной ДНК при температуре 20оС. Затем в
полученные бессолевые водные растворы ДНК добавлялся раствор NaCl до
концентрации ионов Na+ (6Ч10-3 М-1 см-1). Конечная концентрация ДНК в солевых
растворах составляла (1,0-1,2)ґ10-4 М.
2.2 Экспериментальные методы исследования
2.2.1. УФ и видимая спектрофотометрия
Измерения спектров поглощения смесей Act II - ДНК и Act II – ПФ при разных
значениях P/D, где P/D - отношение концентрации фосфатов ДНК и ПФ (Cp0) к
концентрации лиганда (CD0), проводили в термостатированных кварцевых кюветах с
длиной оптического пути 1, 2 и 10 мм на спектрофотометре Specord M40 (Германия)
в видимой и УФ областях спектра.
Поглощение в смесях лиганд – ДНК при любой длине волны согласно закону Ламберта
–Бера можно представить в виде:
, (2.1)
где Сi и еi – концентрация и значение молярного коэффициента экстинкции каждой
частицы в исследуемой системе, а l – длина оптического пути.
При определении концентрации Act II использовали значение молярного
коэффициента экстинкции в изобестической точке, соответствующей мономер –
димерному равновесию, e400 = 1,6ґ104 М-1 см-1[172]. Полученные значения
концентраций использовались в дальнейшем для определения молярных коэффициентов
экстинкции Act II в УФ-области спектра, которые были равны e235=4,52ґ104
М-1см-1 в водном растворе, и e240=4,3ґ104 М-1см-1 в 0,2 М NaCl. При определении
концентрации (в молях фосфатов) разных образцов ДНК использовали следующие
значения молярных коэффициентов экстинкции: e260=6400 М-1см-1 для ДНКthym
[173], e260=6800 М-1см-1 для ДНКМ. lys [83], e260=6200 М-1см-1 для ДНКCl. perf
[173].
Спектрофотометрические измерения в смесях 6AZC – ДНК проводили в УФ области
спектра в кварцевых термостатированных кюветах с длиной оптического пути 10 мм.
Концентрацию 6AZC рассчитывали, используя значение молярного коэффициента
экстинкции: e265 = 10000 M-1 см-1. При тестировании конформационных изменений
(при плавлении) в исследуемых образцах ДНК использовались растворы ДНК и ее
смесей с 6AZC при концентрациях С=(6-10)x10-5 М лиганда и СР =(7-10)х10-5 М ДНК
в молях фосфатов.
2.2.2. Термическая денатурация
Термическую денатурацию свободной ДНК и ДНК в присутствии лигандов исследовали
в УФ области спектра в термостатированных кварцевых кюветах. Кривые плавления
свободных образцов ДНК и смесей ДНК – лиганд были получены в равновесных
условиях, при которых исследуемые растворы выдерживались в каждой из
температурных точек в течение 8 минут (точность измерения температур составляет
0,5 оС).
Величины гиперхромных эффектов смесей ДНК с лигандами были рассчитаны как Г(%)
= (Аmax - Amin)/AДНК , где Amax, Amin и АДНК - поглощения смесей ДНК – лиганд в
l = 260 нм при температуре конца и начала плавления, соответственно,