ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для исследования синаптической передачи в срезах гиппокампа крысы применялись следующие методические подходы:
1) приготовление переживающих срезов гиппокампа (время переживаемости составляло не менее 8 часов);
2) приготовление одиночных клеток СА3-зоны гиппокампа;
3) регистрация возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) и фокальных потенциалов в сочетании с электрической стимуляцией соответствующих зон среза;
4) регистрация аспартат-вызванных НМДА-токов, полученных методом быстрой аппликации агониста, на изолированных клетках.
2.1. Объект исследования.
Препараты центральной нервной системы (ЦНС) млекопитающих, приготовленные в виде тонких срезов ткани, были впервые использованы в качестве объекта электрофизиологических исследований в конце 60-х годов [23]. Переживаемость подобных препаратов и наличие вызванных синаптических популяционных потенциалов в них были впервые продемонстрированы на помещенных в искусственный аналог цереброспинальной жидкости срезах мозга млекопитающих.
Срезы гиппокампа как объект электрофизиологических исследований начали широко применяться в конце 60-х - начале 70-х годов [24]. Повышенный интерес исследователей к этому экспериментальному объекту на ранней стадии исследований объяснялся, в первую очередь, возможностью даже при сравнительно небольшом увеличении морфологически идентифицировать слои, состоящие из структур, сходных по своему строению и функциям. В соответствии с номенклатурой Блэкстэда [25] в число этих слоев входят: alveus - слой аксонов пирамидных нейронов; stratum oriens - слой их базальных дендритов; stratum pyramidale - слой клеточных тел; stratum radiatum - слой малоразветвленных участков апикальных дендритов пирамидных нейронов, а также максимальной плотности коллатералей Шаффера; stratum moleculare - слой сильно разветвленных участков апикальных дендритов. Слой stratum pyramidale подразделяется на поля СА1, СА2 и СА3 (cornu Ammonis, поля 1, 2 и 3). Аксоны нейронов поля СА3 дают коллатерали, формирующие пучок (коллатерали Шаффера), образующие синаптические контакты с дендритами нейронов поля СА1 в слое stratum radiatum.
Синаптическая система "коллатерали Шаффера - пирамидные нейроны поля СА1" удобна для исследования тем, что ее возбуждающий компонент моносинаптичен. Эти данные были представлены в работах Андерсена и сотрудников [26], где было показано отсутствие какого-либо взаимодействия между синапсами, расположенными на разных расстояниях от нейрона поля СА1, в который помещен микроэлектрод для отведения вызванной электрической активности. Исходя из этих данных, можно сделать вывод о том, что амплитуда популяционного потенциала действия, вызванного стимуляцией коллатералей Шаффера и регистрируемого в слое stratum pyramidale поля СА1, может служить мерой эффективности функционирования возбуждающего компонента этой синаптической системы. Был сделан подробный анализ формы вызванных электрической стимуляцией коллатералей Шаффера популяционных постсинаптических потенциалов, регистрируемых как в слое stratum pyramidale, так и в stratum radiatum [27].
Помимо внеклеточного отведения популяционных потенциалов и внутриклеточной регистрации электрической активности отдельных нейронов с четкой идентификацией участков раздражения и отведения, срезы гиппокампа позволяют применять также более сложные и эффективные методические подходы. Сравнительно быстрая (до 5 минут) и полная смена перфузирующего срез раствора позволяет исследовать действие тех или иных физиологически активных веществ на функционирование синаптической передачи. В последнее время широко используется методика локальной аппликации веществ к различным участкам нейронов гиппокампа. Первые эксперименты с применением ионофоретической аппликации глутамата были проведены в 1975 году [28]. В настоящее время ионофоретическая аппликация веществ широко применяется в сочетании с измерением внеклеточной активности ионов Ca2+, K+, Na+ с помощью ион-селективных микроэлектродов [29]. Относительно небольшая оптическая плотность срезов гиппокампа позволяет использовать также ион-чувствительные абсорбционные красители для исследования быстрых и относительно небольших изменений концентрации соответствующих ионов в определенном участке среза. Был, в частности, на основе рН-чувствительного красителя - фенолового красного - разработан метод регистрации быстрых слабых изменений рН в срезах гиппокампа, имеющий временное разрешение до 10 мс и позволяющий регистрировать интегральные изменения активности ионов Н+ величиной до 10-3 ед. рН [30]. Использование срезов гиппокампа позволяет также осуществлять отбор микроскопического количества вещества из определенного участка среза и подвергать его анализу на состав. Это дает возможность исследовать процессы секреции, сопровождающие электрическую активность объекта, и влияние на них различных внешних условий.
Тем не менее методика работы со срезами мозга не лишена ряда недостатков, связанных с тем, что условия переживания нейронов в срезе несколько отличаются от условий их существования в интактном препарате. Морфологический анализ показал, что срезы мозга иногда имеют определенные патологические отклонения [31]. В число таких отклонений входят увеличение толщины аксонов и дендритов, а также образование заполненных водой полостей между нейронами, в частности, возле клеточных тел. Эти отклонения, однако, по прошествии 1?2 часов частично исчезают. Это время является необходимым для преинкубации срезов в искусственной цереброспинальной жидкости после приготовления препарата перед началом экспериментов. Однако подобные отклонения не могут быть полностью устранены. Они, вероятно, объясняются нарушениями работы ионообменных насосов, как это было показано в случае свежеприготовленных препаратов мозга [32]. Показано также, что имеется отчетливая корреляция между электрофизиологическим состоянием среза и степенью его гистопатологических отклонений [33]. Срезы с минималь