РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Досліди проведені на 16 наркотизованих собаках і 85 морських свинках з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами.
2.1. Реєстрація показників кардіодинаміки, коронарного потоку і кисневого режиму ізольованого серця морської свинки
Досліди проводили на ізольованих серцях морських свинок (m = 350 ? 450 г). Тварин декапітували, швидко розтинали грудну клітину і вилучали серце. Для зупинки серця його відразу вміщували в холодний розчин Кребса-Хензеляйта. Серце підвішували за аорту на металеву канюлю за допомогою лігатур, причому діаметр канюлі відповідав діаметрові аорти. Перфузію ізольованого серця здійснювали ретроградно за методом Лангендорфа (рис. 2.1) модифікованим розчином Кребса-Хензеляйта (ммоль/л: NaCl - 118; KCl - 4,7; MgSO4 - 1,2; NaHCO3 - 24; KH2PO4 - 1,2; глюкоза - 10; СаCl2 - 2,5; pH 7,4; t=370C) [19]. Час з моменту розтину грудної порожнини до початку перфузії серця складав не більше 40 с. Притікаючий до серця розчин безперервно аерували сумішшю 95% О2 і 5% СО2. Перфузія коронарних судин здійснювалась з резервуара, віднесеного на висоту 105 см від серця. Постійний перфузійний тиск становив 75?5 мм рт.ст. Рівень розчину у колбі підтримувався за допомогою перистальтичного насосу (Zalimp, Польща). Ізольоване серце лишали на 15-20 хвилин для досягнення постійного рівня показників скорочувальної активності міокарда і тільки після цього починали експериментальний протокол.
У порожнину лівого шлуночка вставляли латексний балончик, з'єднаний з тензодатчиком. Балончик розтягували під тиском 10 см вд.ст. Тиск у лівому шлуночку (ТЛШ), його першу похідну (d?/dtmax, d?/dtmin), кінцево-діастолічний тиск (КДТ) вимірювали тензодатчиком 746. Зазначені параметри реєстрували на багатоканальному полікардіографі
Рис.2.1 Система для перфузії ізольованого серця по Лангендорфу при постійному тиску: 1 - ізольоване серце; 2 - датчик вимірювання тиску у лівому шлуночку; 3 - датчик вимірювання перфузійного тиску; 4 - датчик вимірювання витрат; 5 - колба для обігріву серця; 6 - шприць; 7 -колба для стравлення газу; 8 - редуктор; 9 - резервуар з перфузуємим розчином; 10 - контролер рівня; 11 - гольчатий клапан.
Мінгограф-82 (Елема, Швеція) і одночасно на комп'ютері за допомогою АЦП (DT2801) і програмного забезпечення Global Lab V2.4.
Розраховували: індекс скоротливості Верагутта (ІВ) [153, 10], діастолічну жорсткість лівого шлуночка (ЖЛШ) [51], кількість аритмій впродовж кожних 5 хвилин після початку реперфузії.
Для реєстрації коронарного потоку легеневу артерію надсікали, вводили катетер відповідного діаметру і фіксували. Швидкість коронарного потоку вимірювали за об'ємом відтікаючої від серця рідини за 1 хвилину.
Напругу кисню (pO2) у притікаючому та відтікаючому перфузійному розчині вимірювали за допомогою газоаналізатора BMS 3 Mk-2 (Радіометер, Данія). Розраховували: артеріо-венозну різницю (РО2), об'єм споживання кисню (Q) за методом Neely [118]. Кисневу вартість роботи серцевого м'язу розраховували за формулою:
? = Q/Pлш * ЧСС, (2.1)
де Q - об'єм споживання кисню;
Pлш - тиск у порожнині лівого шлуночку;
ЧСС - частота серцевих скорочень.
Активатори МП феніларсин оксид (ФАО) та антиміцин А додавали в перфузійний розчин протягом 10-ти хвилин. Реєстрацію досліджуваних показників проводили на 3-й, 5-й і 10-й хвилинах під час перфузії препаратів та на 5-й і 10-й хвилинах після відміни введення ФАО і антиміцину А у перфузуємий розчин. В ці ж самі проміжки часу відбирали проби розчину, відтікаючого від ізольованого серця, для спектрофотометричних вимірювань.
Ішемію/реперфузію ізольованого серця моделювали шляхом повної зупинки перфузії коронарних судин на 20 хвилин і наступної реперфузії впродовж 40 хвилин. Реєстрацію досліджуваних показників проводили через кожні 5 хвилин спостереження. Проби відтікаючого від серця розчину, зібрані перед ішемією, на 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 20-й та 40-й хвилинах реперфузії, досліджували спектрофотометрично на спектрофотометрі СФ-46.
Водорозчинний вітамін Е - тролокс та специфічний інгібітор МП - циклоспорин А додавали до перфузійного розчину протягом 10-ти хвилин, після чого моделювали тотальну 20-и хвилинну ішемію. Крім того, тролокс вводили per os за 50 хвилин до виділення серця, далі ішемія-реперфузія за схемою. Розчини для спектрофотометричних вимірювань відбирали в тіж самі проміжки часу, що і в попередньому випадку.
Діетилмаліат (ДЕМ) - скавенжер глутатіону - вводили за попередньою схемою.
Як розчинник для аплікації ряду речовин використовували дистильовану воду та диметил сульфоксид (DMSO).
Результати та оригінальні криві реєстрації параметрів кардіодинаміки обробляли за допомогою ORIGIN 6.0 та Global Lab V2.4.
Перфузійний розчин, що відтікав від легеневої артерії під час реперфузії ішемізованого серця, збирали порційно перші 5 хвилин, з 5 по 20-ту хвилину, з 20-ї по 40-у хвилину. Перфузію другого серця здійснювали за методом Лангендорфа, описаному вище. Після впрацювання протягом 20-30 хвилин розчин Кребса-Хензелайта замінювали перфузійним розчином, який відтікав від легеневої артерії першого працюючого серця в контрольних умовах. Саме цей реоксигенований розчин ми використовували як контрольний, тому що навіть інтактне серце вивільнює в розчин метаболіти, які можуть впливати на функціональну активність другого серця. Реєстрували тиск у лівому шлуночку і першу похідну лівошлуночкового тиску. Розрахункові показники використовували, як описано вище.
2.2. Реєстрація змін тонічної напруги ізольованих суперфузованих препаратів
Експерименти проведені на препаратах трабекули з вушка правого передсердя і кільцевих смужках з сонної артерії морських свинок. Тварин декапітували, серце вилучали з грудної порожнини і поміщали в охолоджений розчин Кребса-Хензеляйта, повністю ідентичний тому, що використовувався в дослідах на ізольованому серці. З вушка правого передсердя в