РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Одержання ікри і характеристика ембріонального розвитку зародків
Об’єктом досліджень були зародки прісноводної риби в’юна
Misgurnus fosslis L.
В’юн широко використовується при дослідженні ряду проблем сучасної біології, в
тому числі в ембріологічних, біохімічних, цитологічних, біофізичних та інших
дослідженнях [23, 61, 62].
Відносно коротка тривалість періоду ембріогенезу цього виду, легкість одержання
статевих продуктів і відсутність особливих труднощів в утриманні цих риб в
лабораторних умовах пояснюють його популярність [66, 70].
В’юн Misgurnus fossilis L. відноситься до родини в’юнових Cobitidae, ряду
Карпоподібних Cypriniformes, надряду кісткових риб Teleastei.
У природних умовах в’юн нереститься в першій половині травня при температурі
води 13-14оС [4, 45]. Відлов особин проводять з жовтня. У лабораторних умовах
ікру можна отримати регулярно з жовтня по червень [70].
Яйцеклітини в’юна по характеру розподілу в них цитоплазми та жовтка відносяться
до типу телолецитальних, а по співвідношенні цих компонентів – до
поліплазматичних. Діаметр зрілої яйцеклітини (без оболонки) складає 1,17 – 1,30
мм [70]. Оболонка яйця складається з добре розвинутої zona radiata і зовнішньої
оболонки ворсинчастої будови. Ворсинки маленькі, злегка виступають над
поверхнею оболонки, а при попаданні у воду стають клейкими і служать для
прикріплення яєць до субстрату [70]. Оболонка дозрілого ооцита в’юна, білкового
походження, але між zona radiata і ворсинчастим шаром є тонка оболонка, яка
містить багато полісахаридів. Білки, які входять до складу zona radiata,
нерозчинні в водних і сольових розчинах, але розчиняються під дією трипсину
[26, 70].
У ділянці анімального полюса яйцеклітини в’юна знаходиться одне мікропіле, і
являє собою лійкоподібне заглиблення поверхні оболонки, яке переходить в
короткий канал. Цей каналець відкривається в цитоплазму на внутрішній поверхні
zona radiata [51, 62, 70], причому діаметр кінцевого каналу відповідає діаметру
головки спермія в’юна.
На анімальному полюсі, у ділянці мікропіле, розташоване ядро на стадії метафази
ІІ, а біля поверхні цитоплазми знаходиться шар кортикальних альвеол [70].
Центральна частина яйцеклітини заповнена дейтоплазматичним включенням
(жовтком). В ооциті білковий жовток накопичується у вигляді гранул, які можуть
досягати діаметру 4,5-4,8 мкм, а при дозріванні яйцеклітин вони залишаються у
вигляді окремих структур [23]. Жирові крапельки в жовтку відсутні.
Запліднення у в’юна зовнішнє, моноспермне. У перші секунди після запліднення
жовткова оболонка відділяється від поверхні яйця і утворює перивітеліновий
простір. Одночасно розпочинається зтягування цитоплазми до анімального полюса
яйця й утворення цитоплазматичного горбика. Тонкий шар цитоплазми оточує
жовток, і, крім того, тонкі її тяжі пронизують жовток, анастомозують між собою
та утворюють в середині жовтка тонку сітку [70, 79]. Після відділення оболонки
і утворення перивітелінового простору діаметр заплідненого яйця дорівнює 1,69
мм [51], а діаметр власне яйця (без оболонки) 1,1 – 1,3 мм. Висота бластодиска
складає 0,35 – 0,45 мм.
Для експерименту використовували яйцеклітини і зародки в’юна Misgurnus fossilis
L., які отримували і запліднювали за методикою Нейфаха [66]. В лабораторних
умовах риб тримали в холодильнику при температурі +4-5оС. Для отримання ікри
самкам внутрішньом’язово вводили хоріогонічний гонадотропін за 24-48 годин до
проведення експерименту. Залежно від пори року і розмірів самки доза гормону
складала від 500 з жовтня до 250 міжнародних одиниць з лютого по червень [4].
Овуляція наступала через 36-40 годин при температурі +19ч+20оС. Самця
декапітували, сім’яники подрібнювали і заливали відстояною водопровідною водою.
Запліднення ікри проводили в чашках Петрі, добавляючи суспензію сперміїв. Для
задовільного запліднення ікри потрібен її контакт із спермою 5-10 хв [66].
Потім запліднену ікру відмивали від сперміїв і інкубували при температурі
21-22оС в розчині Гольтфретера. Стадії розвитку контролювали візуально під
бінокулярним мікроскопом МБС-9.
Для отримання маси клітин зародків на певному періоді клітинного циклу, що
являється необхідною умовою для проведення багатьох біохімічних та біофізичних
досліджень, використовували штучну синхронізацію поділів клітин [67].
Синхронізація клітинних поділів короткочасною зміною температури, на прикладі
ембріональних клітин, здійснюється за допомогою температурних шоків. Зародки
в’юна на стадії середньої бластули, які розвивалися при температурі 18оС,
поміщали на дві години в холодильник (+3оС). Через 15 хв після підвищення
температури до 18оС, спостерігали максимум мітотичного індексу клітин зародків
(50%). Наступний пік мітотичної активності спостерігався через 25-30 хв після
першого і був значно нижчий (18%).
Після одногодинної інкубації зародків при температурі 21,5оС появляються перші
2 бластомери, борозна першого поділу проходить меридіально [70]. У подаль-шому
вік зародків вимірюється величиною фо – умовних одиниць "Детлаф" [26, 30].
Величина фо – тривалість одного мітотичного циклу в період синхронних поділів
бластомерів становить 31 ± 2хв. Через півтора години після запліднення зародки
представлені 4 бластомерами; борозна другого поділу проходить теж меридіально,
але перпендикулярно борозні першого поділу. Вісім бластомерів з’являються на
стадії 4фо, 16 бластомерів – на стадії 5фо. Через 3 години після запліднення
зародки представлені 32 бластомерами, але борозни 5-го поділу проходять
паралельно еква-тору жовтка, в результаті чого утворюється "шапочка" на
анімальному полюсі, тобто бластодиск, клітини якого не відділені
- Київ+380960830922