РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Виділення ізольованих гладеньком’язових клітин
Експерименти проводили на поодиноких гладеньком’язових клітинах, ізольованих із
епідидимальної частини сім`явивідних протоків щура. В експериментах
використовували дорослих (8 – 10 тижнів) тварини чоловічої статі лінії Вістар
масою 200-300 г. Тварин присипляли за допомогою ефіру, а потім декапітували.
Рис. 2.1. Статеві органи самця щура. (Рисунок взято з [20])
Поодинокі гладеньком’язові клітини епідидимальної частини сім`явивідних
протоків щура (див. рис. 2.1, взято з посібника “Experiments on isolated smooth
muscle preparations”, HSE Biological Measuring Techniques, 1978) отримували за
допомогою методу ферментативно-механічної ізоляції. (Епідидимальною називають
більш тонку частину сім’явивідного протоку, яка прилежить до сіменника, у той
час як більш товсту частину, яка прилежить до передміхурової залози та
сечовивідного каналу, називають простатною.) Сім’явивідні протоки вирізали та
відділяли від жирової та сполучної тканини в номінально безкальцієвому розчині
(розчин А, таблиця 2.1.) при кімнатній (22 – 24 оС) температурі, та
відокремлювали епідидимальну частину від простатної. Очищені від сполучної
тканини шматки епідидимальної частини розрізали вздовж, видаляли внутрішній
епітеліальний шар, потім розрізали на шматочки довжиною 1,5 – 2 мм та поміщали
на 10 хвилин у свіжий гіпокальцієвий розчин наступного складу (у мМ): NaCl 135;
KCl 6; CaCl2 0,1; MgCl2 1,2; D-глюкоза 5; HEPES 10; pH 7,35 – NaOH при
температурі 36 С. Після цього шматки переносили до номінально безкальцієвого
розчину, який містив 1,5 мг/мл колагенази ХІ типу, 0,5 мг/мл протеази Х типу та
1,5 мг/мл бичачого сироваткового альбуміна. У цьому розчині шматочки тканини
інкубували на протязі 20-25 хвилин при температурі 36 оС. Після інкубації
шматочки тканини ретельно відмивали в безкальцієвому розчині (А). Функціонально
повноцінні ізольовані гладеньком’язові клітини епідидимальної частини
сім`явивідних протоків щура отримували шляхом багаторазового пропускання
шматочків тканини через пастерівські піпетки з різними діаметрами кінчиків у
свіжому номінально безкальцієвому розчині, який містив 0.1% бичачого
сироваткового альбуміну. Помутніння цього розчину свідчило про виділення
ізольованих ГМК. На протязі екперименту ізольовані міоцити зберігали в цьому ж
розчині при температурі 5 оС.
Отримані ізольовані ГМК vas deferens щура мали середній розмір 80 х 5 мкм,
високий вхідний опір (1-5 ГОм), зберігали всі компоненти іонних провідностей,
які характерні для нативної мембрани, скорочувались у відповідь на прикладання
гіперкалієвого розчину. Ці показники свідчили про те, що мембрана та
скорочувальний апарат ізольованих ГМК збереглися в нормальному функціональному
стані.
2.2. Електричні вимірювання
Для реєстрації калієвих струмів (IК) ізольованих гладеньком’язових клітин
епідидимальної частини сім`явивідних протоків щура застосовували модифікацію
“perforated patch” методу “patch-clamp” із використанням антибіотика
амфотеріцина Б. Опір піпеток, заповнених внутрішнім розчином, становив
1-3 МОм.
Принцип методу полягав у створенні щільного (гігаомного) контакту між стінками
кінчика піпетки та мембраною клітини. Для утворення гігаомного контакту
мікропіпетку підводили до поверхні клітини та створювали незначний від’ємний
тиск. Доступ до цитоплазми клітини утворювався в результаті перфорування
ділянки мембрани під піпеткою амфотеріцином Б. Внаслідок дифузії відбувалась
заміна моновалентного іонного складу внутрішньоклітинного середовища на
внутрішньопіпетковий розчин.
Досліди проводили при кімнатній температурі (22 – 24 оС). Фіксація потенціалу
та реєстрація струмів здійснювилась за допомогою підсилювача PATCH-CLAMP L/M
EPC 7 (List Electronics, Німеччина) з опором зворотнього звязку перетворювача
струм-напруга 500 МОм. Сигнал з виходу підсилювача потрапляв на
аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200A (Axon Instruments) та далі в
комп’ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програми “pCLAMP 5.5”.
Результати статистичної обробки даних представлені в тексті та на малюнках як
середнє арифметичне ± стандартне відхилення від середнього арифметичного. Дані
порівнювали парним
t-тестом Стьюдента для чисельних порівнянь. Відмінності вважали статистично
вагомими при значенні Р<0.05.
2.3. Мікропіпетки
Мікропіпетки для вимірювання іонних струмів гладеньком’язових клітин
епідидимальної частини сім`явивідних протоків щура виготовляли з м’якого
молібденового скла за методикою, описаною в роботі Hamil, Marthy & Neher [56].
Виготовлення мікропіпеток проводилось в одну стадію за допомогою модифікованої
кузні МЕ-4. На кінцевій стадії проводили теплову поліровку кінчиків
мікропіпеток. Опір мікропіпеток, заповнених розчинами Д та Е, становив 1-4
МОм.
2.4. Заміна розчинів
Для проведення досліджень суспензію клітин поміщали в експериментальну камеру
об’ємом 500 мкл із скляним дном, яка прикріплена до столика інвертованого
мікроскопа. Через 5-7 хвилин починали перфузію зовнішнім розчином, при цьому в
камері залишались тільки клітини, які закріпились на її дні. Для дослідів
вибирали розслаблені, видовжені клітини з гладенькою поверхнею. Всі
дослідження, описані в роботі, були проведені на свіжоізольованих клітинах,
оскільки відомо, що міоцити в культурі можуть змінюватись як морфологічно, так
і структурно-функціонально. Досліджувані речовини додавали до зовнішнього
розчину в концентраціях, які вказані в тексті дисертації. Розчини в робочій
камері під час експерименту замінювалися поступово, на протя
- Київ+380960830922