РАЗДЕЛ 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ШПИЛЕЧНЫХ СТРУКТУР
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РАСТВОРЕ
2.1. Экспериментальные методы изучения шпилечных форм нуклеиновых кислот
Экспериментальные методы молекулярной биофизики, используемые для изучения шпилечных структур нуклеиновых кислот в растворе, можно разделить на две группы: качественные, позволяющие установить наличие шпилечной структуры, и количественные, с помощью которых могут быть получены термодинамические и (или) структурные параметры шпилек. К основным методам первой группы относятся химическая модификация, ферментативное расщепление и гель-электрофорез, ко второй - спектроскопические методики, в частности, УФ-спектрофотометрия и ЯМР-спектроскопия.
Применение метода химической модификации основано на преимущественном взаимодействии некоторых реагентов с азотистыми основаниями однонитевых участков нуклеиновых кислот по сравнению с дуплексными. При наличии шпилечных структур в растворе такая специфичность реакций приводит к модификации петлевых азотистых оснований, что позволяет идентифицировать шпильку. Так, бромацетальдегид реагирует с аденозиновыми и цитидиновыми основаниями, диэтилпирокарбонат - с атомом N7 аденозина и гуанозина [278], а перманганат калия - с метильной группой тимидина [279] однонитевой ДНК.
Установление присутствия шпилечных форм в растворе при помощи ферментативного расщепления возможно ввиду специфичности эндонуклеаз (как правило, используется P1) к однонитевым участкам ДНК, что также позволяет обнаружить шпилечные структуры по разрушению их петель [57,279-281].
Наиболее распространенным качественным методом изучения шпилечных структур нуклеиновых кислот является полиакриламидный гель-электрофорез. Его преимуществом является возможность разделения различных олигонуклеотидных компонентов геля между собой, что обусловлено их различной подвижностью в постоянном электрическом поле. Так, у шпилечных структур она выше, чем у мономерных и димерных форм ДНК, а у более компактных шпилек - выше по сравнению с имеющими менее упорядоченную структуру [73,118,126,127]. Сочетание гель-электрофореза с денатурацией молекул нуклеиновых кислот позволяет оценить их сравнительную стабильность. Как правило, при этом используется термическая [282,283] или химическая (7...8 М раствор мочевины) [284,285] денатурация.
Широко применяемый метод УФ-спектрофотометрии молекул нуклеиновых кислот в растворе основан на использовании явления гиперхромизма азотистых оснований [286]. Для A:T пар гиперхромизм максимален при длине волны ?=260 нм, для G:C пар - при ?=280 нм [287]. Из температурной зависимости оптической плотности раствора нуклеиновой кислоты D(T), используя модель двух состояний (шпилька-мономер), могут быть получены термодинамические параметры реакций образования шпилечных структур нуклеиновых кислот в растворе и их температуры плавления Tm [288]. При этом критерием фактического отсутствия в исследуемом растворе димерных форм является независимость величины Tm от концентрации олигонуклеотида [122]. В случае же наличия в растворе дуплекса кривая плавления является двухфазной с двумя значениями Tm, из которых одно соответствует плавлению димера, а второе - шпильки [145]. Однако плавление шпилечных форм некоторых олигомеров, например, d(CGCAAATTCGCG), не сопровождается гиперхромизмом [289]. К недостаткам УФ-спектрофотометрии относится также невозможность получения структурных характеристик шпилечных структур. В то же время, известно, что структура шпилек ДНК во многом определяет их стабильность и биологическую роль (см. пункт 1.4.2).
Метод ЯМР-спектроскопии позволяет получить информацию о пространственной организации и динамических особенностях структуры биологически важных молекул в условиях, близких к физиологическим, на атом-атомном уровне. Это обусловило широкое применение ЯМР-спектроскопии в биофизических исследованиях и в клинической практике [290-292].
2.2. Физические основы одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии
ЯМР-спектроскопия - это метод исследования биомолекул, основанный на свойстве атомных ядер ориентироваться в сильном магнитном поле, поглощая электромагнитное излучение характерных частот.
На практике наиболее широкое применение получили методики импульсной ЯМР-спектроскопии, в которых на исследуемый образец, находящийся в стационарном магнитном поле, подаются радиочастотные импульсы определенных длительностей и последовательностей [293]. Рассмотрим поведение ядер, например, протонов, со спиновым квантовым числом, равным s=1/2. Пусть вектор индукции магнитного поля B0 направлен вдоль оси Z, тогда возможны две ориентации Z-компонент магнитных моментов M протонов по отношению к направлению внешнего поля: параллельная (при значении магнитного квантового числа m=1/2) и антипараллельная (при m= -1/2). При этом направление результирующей намагниченности образца M0 в силу большей заселенности нижнего уровня будет совпадать с положительным направлением оси Z (рис. 2.1).
Чтобы привести вектор M0 в движение, в стандартном одномерном ЯМР-эксперименте [293] к системе спинов прикладывают 90?-ный импульс В1, направленный вдоль оси ? и создающий поперечную намагниченность, которая совпадает по направлению с осью ?.
Рис. 2.1. Ориентация магнитных моментов ядер с m=1/2 во внешнем магнитном
поле с индукцией B0 (|М?z|<|М?|)
По окончании действия импульса поперечная намагниченность M? будет прецессировать вокруг оси Z, которая создаст в катушках детектора сигнал S(t), называемый сигналом спада свободной индукции (ССИ). После преобразования Фурье функции S(t) получают частотный спектр S(?) (рис. 2.2 а,б).
а б
Рис. 2.2. Импульсная последовательность (а) и частотный спектр S(?) (б)
Резонансная частота ядер, входящих в состав молекул, будет отличаться от частоты свободного ядра вследствие экранирован