РАЗДЕЛ 2
Материалы и методы исследований
Для исследования изменения активности Са2+ каналов нейронов гиппокампа при уменьшении напряжения кислорода во внеклеточном растворе использовались следующие методические подходы:
* культивирование нейронов гиппокампа;
* выделение остроизолированных клеток из срезов гиппокампа при использовании метода вибродиссоциации нервных клеток;
* метода "пэтч-клэмп" в конфигурации "целая клетка" для регистрации кальциевого тока;
* полярографический метод определения напряжения кислорода во внеклеточном растворе.
Условия гипоксии модулировались уменьшением pO2 до 10 мм.рт.ст. во внеклеточном растворе, который не содержал глюкозу. Понижение напряжения кислорода внеклеточного раствора осуществлялось насыщением раствора N2. Гипоксический и раствор контроля заменялся непосредственно возле исследуемой клетки при протоке раствора через систему протока, основанную на микро-клапанах (Компания Lee, США). Скорость потока раствора была приблизительно 0.5мл/минут, что позволяло изменять раствор в близком расстоянии от клетки. Кислород-чувствительный электрод располагался непосредственно возле регистрируемой клетки, что позволяло знать точное значение напряжения кислорода около её поверхности.
2.1. Объект исследований
Тот факт, что гиппокамп является хорошо изученной структурой, которая играет важную роль в организации центральной нервной системы, делает его привлекательным для изучения механизмов гипоксии. Кроме того, гиппокамп является наиболее чувствительной структурой мозга к гипоксии, при этом теряется возбудимость его нервных клеток [201]. На срезах гиппокампа крыс СА1 зоны показано, что освобождение Са2+ из внутриклеточных депо есть основной компонент ответа на гипоксию, вызванного понижением напряжения кислорода [202]. В гиппокампальных нейронах прекращение электрической активности объясняют K+ проводимостью, нейрональной гиперполяризацией и исчезновение синаптических потенциалов, которые, вероятно, являются защитными механизмами, предотвращающие ущерб клетки. Эти изменения вызваны сигналами - повышением цитоплазматического свободного кальций и уменьшение внутриклеточного ATP. Продолжительный недостаток кислорода и глюкозы при гипоксии приводит к тому, что система защиты клетки становятся несостоятельной предотвратить накопление чрезмерного притока Ca2+ в клетку, который вызывает запуск механизмов, инициирующие гибель клетки. [1]
2.1.1. Функции гиппокампа
Очень сложно выделить в гиппокампе какую-нибудь одну функцию. Факты показывают, что гиппокамп имеет отношение к памяти, к эмоциям, к образованию временной связи, к висцеральной активности и к общей тормозной системе. Наиболее распространенными в наше время представления о функциях гиппокампа можно объединить в несколько больших групп: гиппокамп - центр эмоций и мотивации; гиппокамп является собой аппаратом, отвечающий за механичную память; важную роль гиппокамп играет в условно-рефлекторном поведении [203].
2.1.2. Гиппокамп как объект электрофизиологических исследований
Препараты ЦНС млекопитающих, приготовленные в виде тонких срезов, были впервые использованы в качестве объекта электрофизических исследований в конце 60-х годов прошлого столетия. Сами срезы гиппокампа начали использоваться значительно позднее: в конце 60-х в начале 70-х годов [203]. Четкое внутреннее построение и небольшая глубина от поверхностного мозга позволили провести детальное изучение свойств, как индивидуальных нейронов, так и групп клеток гиппокампа. В частности, была выявлена способность гиппокампа генерировать ритмическую активность, а именно, так называемый, тета-ритм, один из компонентов ориентировочного рефлекса [204].
Значительным толчком для использования гиппокампа для электрофизиологических исследований стала методика приготовления тонких (до 300мкм) срезов коры головного мозга млекопитающих [205]. Такие срезы способны на протяжении длительного времени генерировать вызванные потенциалы, что свидетельствует о сохранении сложных функций. Представление о ламеллярном построении основных возбуждающих путей гиппокампальной формации [206] стало морфологическим обоснованием широкого использования срезов гиппокампа в современной электрофизиологии.
Относительно небольшая оптическая плотность срезов гиппокампа позволяет применять ионочувствительные абсорбционные красители для исследования быстрых изменений концентрации некоторых ионов в срезах и индивидуальных нейронах, в частности, ионов Са2+ [207].
Одновременно существуют определенные недостатки в работе со срезами мозга, что связано с отличием условий in vitro от интактного препарата. Морфологический анализ показал, что срезы часто имеют патологические отклонения [208]. В частности, увеличивается диаметр клеточных тел, в межклеточном пространстве образуются пустоты заполненные водой. Эти изменения, вероятно, объясняются нарушением работы ионообменных насосов вследствие травмы при приготовлении препарата; они отчасти исчезают за 1-2 часа инкубации срезов в искусственной цереброспинальной жидкости. Поскольку наблюдается определенная корреляция между гистопатологическими отклонениями и уровнем электрической активности среза, то в последнее время выработаны стойкие морфологические и электрофизиологические критерии жизнеспособности таких препаратов [209].
2.1.3. Мембранные токи нейронов гиппокампа
Далее представлены сведения об ионных токах клеток гиппокампа [210], полученные из регистраций в условии фиксации напряжения.
2.1.3.1. Na+-токи
В гиппокампальных нейронах существует два типа натриевых токов: быстрый ток INa(fast) и медленно инактивирующийся ток INa(slow). Быстрый натриевый ток [211] характеристики которого описаны в уравнениях Ходжкина-Хаксли, имеет активационный порог
-60 мВ и время до пика около 0.9 мс при 0 мВ, потенциал половинной активации -39 мВ. Инактивация тока при 0 мВ является двухэкспоненциальной, с половинным временем инактивации около 2 мс. В 15 из 120 клеток гиппокампа регистрировалась более быстрая (<1 мс) ин
- Київ+380960830922