Розділ 2
МЕТОДИ ТА БАЗОВІ МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТІВ ПО ДОСЛІДЖЕННЮ ХЛ
2.1 Підготовка біооб'єктів до експерименту
Для дослідів використовували С (плазма крові без білка фібриногену) здорових людей, людей з онкологічними патологіями, захворюваннями на туберкульоз та саркоїдоз. СК являє собою досить складне біологічне середовище. В склад СК входить вода і сухий залишок.
Приготування крові для аналізів здійснювали за наступною схемою: кров людини береться зранку натще з ліктьової вени в чисті сухі пробірки без антикоагулянту. Після центрифугування крові (15 хв. при 2000 об/хв) кров готова для аналізу.
Літературні дані свідчать, що жовток курячих яєць містить два ліпід білкових комплекси, які по своїм фізико-хімічним властивостям відповідають фракціям ліпопротеїдів низької та дуже низької густини СК. Ця модель має кілька важливих переваг: вона відрізняється своєю доступністю, простотою отримання, стабільністю при зберіганні, що збільшує відтворення результатів, і, разом з тим, високою окиснювальністю, що дозволяє використовувати звичайні лабораторні пристрої для визначення рівня пероксидації ліпідів. Саме тому в деяких дослідах використовувався жовток.
2.2 Приготування реактивів
2.2.1 Розчин сульфату заліза
Розчин сульфату заліза (0,02 мМ) готується шляхом розчину навіски 0,28 г в 50 мл бідистильованої води безпосередньо перед вживанням. Розчин має бути прозорим.
Таблиця 2.1
Приготування необхідної концентрації.
Мольна концентрація розчину (мМ)Вага
(г)Об'єм бідистильованої води (мл)0,0010,014500,010,14500,0150,21500,020,28500,030,42500,060,42250,10,725
2.2.2 Фосфатний буфер
Фосфатний буфер готується з навісок -1,361 г. і -3,9144 г. в 0,5 л. бідистильваної води. До необхідного доводять з допомогою таблетованого . Такий робочий буфер підлягає використанню на протязі двох тижнів. Зберігається в холодильнику.
2.2.3 Розчин перекису водню
Розчин перекису водню готується з стандартного пергідролю, доводячи його шляхом розведення бідистильваною водою до необхідної концентрації див.табл.2.2
Таблиця 2.2
Приготування перекису водню необхідної концентрації
Концентрація перекису водню (%)Об'єм пергідролю (мл) Об'єм бідистильованої води (мл)0,515611281,535622282,55563328421655286316841610516
2.3 Установки для проведення досліджень та її характеристики
Для усіх дослідів, за виключенням експериментів на дослідження спектра, використовувався біохемілюмінометр БХЛ- 06.
Біохемілюмінометр використовується для вивчення світлового випромінювання, що виникає в біологічних системах при протіканні в них ферментативних та хімічних реакцій. Біохемілюмінометр може бути використаний як для аналізу біолюмінесцентних реакцій, так і для аналізу вільнорадикальних хемілюмінесцентних процесів (ПОЛ).
Програмне забезпечення дозволяє спостерігати кінетику процесу, розраховувати параметри сигналу, документувати дані експерименту, накопичувати базу даних та проводити порівняння, як окремих експериментів так і груп експериментів. Серед параметрів експерименту знімаються максимальна інтенсивність сигналу та момент часу в який вона зафіксована, інтегральна світлосумма сигналу на протязі усього експерименту, світлосумма сигналу до максимальної інтенсивності сигналу. Найбільш інформативними являються реєстрація максимальної інтенсивності ХЛ, час її розвитку та світлосума свічення.
Рис. 2.1. Функціональна схема кюветного блоку: 1-плата перемикачів, 2-плата термостабілізації, 3-регулювання перемішування, 4-блок ФЕП, 5-високовольтне джерело живлення ФЕП, 6-стабілізатор живлення, 7-підсилювач імпульсний, 8-підсилювач аналоговий, 9-АЦП.
При вимірюванні використовувалися кварцові кювети циліндричної форми діаметра d=0,5см та висоти h=1см.
Хемілюмінометр має наступні технічні характеристики:
* Чутливість, кв/імп, не більше ------------------100000
* Коефіцієнт підсилення ----------------------- от 1 до 100
* Температура, ?С, яка підтримується в
кюветному відділі, при температурі
навколишнього середовища
18?1?С ------------------------від 20 -до 42?С з кроком 2?С
* Точність підтримки температури, не гірше ------- ?0,1 ?С
* Швидкість обертання вимірювальної кювети,
об/хв, ----600-1000.
В склад біохемілюмінометра входять :
-блок кюветний;
-пристрій зв'язку з зовнішнюьою ЕОМ (АЦП)
-програмне забезпечення
Принцип роботи хемілюмінометра базується на реєстрації надслабких світлових потоків, що постійно відбуваються в біологічних системах та виникають у біооб'єктах при дії на них специфічних факторів.
Для зняття спектру використовувався спектрофотометр.
На рисунку зображено функціональну схему наступного.
УФП=140В, ФЕП-51, ПДА-1, У=1 мВ/см, при максимальній щілині.
Рис. 2.2 Функціональна схема спектрофотометра: 1-кюветне відділення, 2-термостат, 3-канал реєстрації (фотопомножувач), 4-перетворювач, 5-самописець, 6-фотопідсилювач, 7-підсилювач, 8-лазер ЛГІ-21
Для досліджень використовувалась СК людей (5 мл)+10 мл фосфатного буфера + 10 мл бідистильованої води . Кювета з СК витримувалася в термостаті 20 хв. при температурі 38. Після цього кювета опромінювалась паралельним пучком світла лазера ЛГІ-21 (-337,1 нм), інтенсивність спектру ХЛ знімалася з усього об'єму зразка.
При вимірюванні використовувалися кварцові кювети з квадратною основою (площею основи S=0,25см), та висотою h=5 см.
2.4 Методики для проведення дослідже