РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Метод ферментативного выделения сенсорных нейронов
Эксперименты, описанные в данной работе, выполнялись на изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс линии Wistar в возрасте 8 - 10 недель при изучении влияния СТЗ-индуцированного диабета на потенциалуправляемые кальциевые токи и крыс возраста 3 - 4 недель при изучении влияния ацидоза на эти же токи. Для получения изолированных клеток использовалась стандартная процедура ферментативной изоляции. Животное декапитировали под легким эфирным наркозом и выделяли грудные и поясничные спинальные ганглии, которые помещали в охлажденный до 4°С раствор Тироде на 15-20 минут (состав растворов приведен ниже). После отмывания ганглии переносили в покрытый силиконом пенициллиновый флакон с 2 мл подогретого до 36°С раствора Тироде с добавлением 1 мг/мл протеиназы (тип XXIII, Sigma, США) и 0,5 мг/мл коллагеназы (Sigma, США) и выдерживали при указанной температуре в течение 37 минут, обеспечивая постоянное перемешивание раствора. После ферментативной обработки ганглии отмывали не содержащим ферменты раствором Тироде той же температуры в течение 20 минут. Для получения клеточной суспензии ганглии пипетировались с помощью стеклянных оплавленных Пастеровских пипеток в течение 5 минут в 0,5 мл раствора Тироде. Полученную суспензию наносили на чистое покровное стекло, прикрепленное с помощью вакуумной силиконовой смазки к дну специальной пластиковой камеры и выдерживали в термостате при 36°С в течение 1 часа для прикрепления клеток к стеклу. Клетки использовались в эксперименте в течение 6-8 часов после выделения. Контрольные эксперименты показали, что изолированные таким методом нейроны сохраняют свои основные характеристики в течение 12 часов.
Для экспериментов отбирались фазово-контрастные нейроны с диаметром сомы (18 - 40 мкм) и хорошо прикрепившиеся к дну экспериментальной камеры.
2.2. Модель стрептозотоцин-индуцированного диабета
Одним из самых распространенных методов, применяемых для индукции диабета, является внутривенное или внутрибрюшинное введение цитотоксического агента ?-клеток - стрептозотоцина (СТЗ).
Стрептозотоцин был открыт в конце 1950х как антибиотик, выделяющийся из почвенных бактерий Streptomyces achromogenes. С химической точки зрения СТЗ состоит из D-глюкозамин производной
N-метил-N-нитрозомочевины. (рис.2.1)
Рисунок 2.1. Химическая формула стрептозотоцина
Многочисленные исследования достоверно показали, что СТЗ проникает в инсулин-производящие ?-клетки островков Лангерганса через специфический мембранный транспортер глюкозы GLUT-2, распадается внутри клетки на остаток глюкозы и нитрозомочевину, что приводит к повышению внутриклеточной концентрации NO и пироксинитрита (NO3), которые в свою очередь повреждают спираль ДНК и разрушают митохондрии, что ведет к гибели клетки и к прекращению выработки инсулина [217].
Прямое действие стрептозотоцина на центральную нервную систему при его внутривенном и внутрибрюшинном введении исключается вследствие того, что гематоэнцефалический барьер, а также сами нервные клетки непроницаемы для стрептозотоцина, так как в них отсутствует специфический транспортер глюкозы. Отличием этой модели диабета от диабета у человека, является то, что животные со стрептозотоцин-индуцированным диабетом не нуждаются в постоянном введении инсулина, несмотря на развитие у них гипо-инсулемии и гипергликемии. Для заболевших животных, характерным является уровень глюкозы в плазме крови порядка 19-25 мМ. Подобно людям, больным диабетом, у грызунов со стрептозотоцин-индуцированным диабетом развиваются повреждение внутренних органов, глаз, почек, сердца, кровеносных сосудов и нервной системы [218]. Преимущества модели стрептозотоцин-индуцированного диабета состоят в том, что она на сегодняшний день является наиболее подробно описанной, а также то, что диабет может быть вызван в любом заданном возрасте. Это может особенно быть полезно, если процедура получения клеток лимитирована определенными возрастными рамками, а также при изучении взаимодействия диабета и старения. Хотя модель доказала свою безусловную адекватность и полезность в изучении эффекта хронической гипергликемии, ее невозможно поставить в строгое эндокринологическое соответствие 1-му типу сахарного диабета, ввиду неадекватности ее патогенезиса в сравнении с таковым у человека.
В модели экспериментального диабета мы использовали самцов крыс линии Вистар в возрасте 21 постнатального дня. Для получения экспериментального диабета животным производилась внутрибрюшинная инъекция 1 мл раствора стрептозотоцина, (Sigma, США) в 0.9-ти процентном растворе NaCl (изотонический 0.9% раствор для инъекций, Галичфарм, Львов, Украина), в концентрации из расчета 80 мг на кг веса животного. Через сутки производилась повторная инъекция. На протяжении всего периода наблюдений как стрептозотоцин - инъецированные, так и контрольные животные такого же возраста, содержались в идентичных условиях, на одинаковой диете.
Через 3 недели после первой инъекции стрептозотоцина измерялся уровень глюкозы в плазме крови животных. Концентрация глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены, измерялась при помощи оптического сенсора глюкозы Глюкотренд (Roche Diagnostics GmbH., Mannheim, Германия). Концентрация глюкозы в плазме крови контрольных животных находилась в пределах 5 - 9 мМ. Если у стрептозотоцин-инъецированного животного концентрация глюкозы превышала 15 мМ, мы считали, что у животного развился стрептозотоцин - индуцированный диабет.
Стрептозотоцин-инъецированные и контрольные животные такого же возраста содержались в одинаковых условиях на протяжении всего периода развития заболевания. Часть животных бралась в эксперимент через один день после инъекции стрептозотоцина (стрептозотоциновый контроль), исследования, проведенные на данной группе животных, не выявили отличий в плотности кальциевых токов по сравнению с контрольными неинъецированными животными, поэтому