РОЗДІЛ 2
ОБ`ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об`єкт та предмет досліджень
Досліджували формування популяцій M. ciceri та зміни їх чисельності при вирощуванні нуту в польових сівозмінах; вплив сорту нуту, штаму бульбочкових бактерій і азотних добрив на формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу C. arіetіnum - M. ciceri і продуктивність рослин.
Предметом досліджень були штами M. ciceri: виробничі - 520, 522, 527, люб'язно надані А.П.Кожемяковим з колекції ARIAM (ВІСГМ РАСГН, Санкт-Петербург, Росія), 13 перспективних і 55 нових штамів, виділених в лабораторії біологічного азоту і фосфору ПДС ІСГМ УААН відповідно у 1987-1995 рр. та 2002-2003 рр.; препарат ризобофіт під нут на основі штаму Н-12, виготовлений у лабораторії технічної мікробіології ПДС ІСГМ УААН за технологією соєвого ризобофіту (ТУ У 319. 00494456-006-2000).
В дослідах використовували сучасні сорти нуту, які рекомендовані для вирощування у зоні Степу України - Олександрит, Розана, Пам'ять, Тріумф, отримані з СГІ НАЦНАС УААН і Смачний, Колорит, Луганець - з ЛІ АПВ УААН (табл. 2.1).
В польових дослідах застосовували найбільш розповсюджене в Україні мінеральне азотне добриво - аміачну селітру. Це амонійно-нітратне добриво, яке містить азот у аміачній та нітратній формах, у ньому вдало сполучаються швидкодіючий нітратний азот з менш рухливим амонійним. Аміачна селітра - фізіологічно кисле добриво, добре розчиняється у воді, гігроскопічне [197, 198]. Класифікаційний шифр аміачної селітри, яка застосовувалася у дослідах - 5113, ГОСТ 2-85, марка - В, масова частина азоту складала не менш 34,4 %. Мінеральні азотні добрива були виготовлені у гранульованій формі ЗАТ "Северодонецкое объединение Азот".
Таблиця 2.1
Характеристика сортів нуту
Сорт нуту Рік занесення у Реєстр сортів рослин УкраїниТип сортуВисота рослин (см)
Маса 1000 зерен
(г)
Вегетаційний період (діб)
Вміст білку у зерні
(%)
Урожай зерна (серед-нє за роки сортовип-робнування, ц/га)Луганець1994Desi65-71240-26098-10324,0-25,015,9Колорит2000Desi40-8029794-9826,031,0Олександрит2001Desi45-55275-29092-9623,1-26,417,9Смачний1999Kabuli55-6024487-9826,420,9Розана2000Kabuli50-60290-31095-10025,0-26,018,6Пам'ять 2002Kabuli50-55280-30090-
9528,0-30,017,4Тріумф
2005Kabuli55-60415-42091-9826,4-28,115,7
Досліджували динаміку бульбочкоутворення і нітрогеназної активності як показників формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу нуту з бульбочковими бактеріями, ефективність якого оцінювали за підвищенням урожаю абсолютно сухої надземної фітомаси, зерна нуту та збору "сирого" протеїну.
2.2. Методи досліджень
Дослідження проводили в лабораторних, вегетаційних та польових умовах. Вегетаційні досліди проводили у теплиці на базі Південної дослідної станції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН у 2002-2005 роках. Польові дослідження проводили протягом чотирьох років у підзоні південного Степу України:
- у 2002-2005 роках - на дослідних ділянках ПДС ІСГМ УААН (АР Крим, р-н Сімферопольський, смт. Гвардійське) та ПФ КАТУ НАУ (АР Крим, р-н Сімферопольський, с. Аграрне);
- у 2003 році - на полях експериментальної бази дослідного господарства "Дачне" СГІ НАЦНАС УААН (Одеська обл.) та Кримського інституту АПВ (АР Крим, р-н Красногвардійський, с. Клепініно).
Виділення бульбочкових бактерій нуту з бульбочок рослин проводили згідно методичних рекомендацій ВНДІСГМ РАСГН [199]. Культуральні та фізіолого-біохімічні особливості штамів ризобій нуту вивчали згідно загальноприйнятих методів мікробіології і біохімії [200, 201], експериментальної медичної бактеріології [202] та методичних рекомендацій ВНДІСГМ РАСГН [203]. Ідентифікацію бульбочкових бактерій нуту проводили за визначником Бергі [114] і відносили до виду бактерій, що нодулюють нут (C. аrіetіnum) [204, 205]. Стандартом був ефективний виробничий штам M. cіcerі 527.
Електронно-мікроскопічні дослідження для визначення розмірів клітин, наявності джгутиків у штамів M. cіcerі проводили методом негативного контрастування 2,0 % розчином фосфорно-вольфрамової кислоти (ФВК), яку доводили до рН 7,2 розчином 1 N NaOH [206]. Використовували 7-добові культури, які вирощували на скосах бобового агару. Бактеріальну масу на кінчику мікробіологічної петлі розтирали у краплі стерильної води. На мідні опорні решітки з формваровою плівкою-підкладкою наносили суспензії різних штамів M. cіcerі і витримували їх протягом 3 хвилин. Контрастування проводили також протягом 3 хвилин. Надлишок рідини видаляли за допомогою фільтрувального паперу та висушували на повітрі. Клітини різних штамів бульбочкових бактерій нуту проглядали на електронному мікроскопі В-S540 "Tesla" при 75 кВт та робочому збільшенні на екрані х 7500 або 10000.
Нітрогеназну активність бульбочок аналізували ацетиленовим методом на газовому хроматографі "Chrom-5" з полум'яно-іонізаційним детектором [207, 208].
Біопрепарати на основі штаму M. cіcerі Н-12 для нітрагінізації насіння нуту виготовляли за технологією ризобофіту для сої (ТУ У 319.00494456-006-2002). Гетерофазний препарат виготовляли шляхом внесення в рідке середовище для культивування повільнорослих бульбочкових бактерій (ПББ) 2% пилоподібного вермикуліту [209]. Титр бульбочкових бактерій нуту в препаративних формах визначали методом граничних розведень з висівом на агаризоване бобове середовище [200, 201].
Вміст загального азоту в усереднених зразках зерна нуту, ячменю та вівсу визначали методом К'єльдаля на автоматизованій системі "Kjeltec-Auto 1030" (Tecator, Mft'd, USA) та перераховували на "сирий" протеїн, використовуючи коефіцієнт - 6,25 [210].
Чисельність бульбочкових бактерій нуту в ґрунті визначали модифікованим методом Красильнікова-Кореняко на стерильних паростках нуту в умовах напівстерильного вегетаційного досліду [211]. Насіння нуту сорту Олександрит стер