РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Пацієнти
Фібробласти трофічних виразок були отримані від 20-ти пацієнтів (вік від 46 до 75 років) із хронічними венозними виразками нижніх кінцівок Тривалість існування хронічних виразок у всіх пацієнтів нараховувала більше 12-ти місяців, виразкові дефекти мали середню площу понад 45 см2 і були повністю або частково висічені для подальшого аутологічного закриття дефектів з використанням різних варіантів дермопластики. Біопсійний матеріал було отримано у момент висічення виразкових дефектів. Цю групу складали пацієнти, у яких на момент взяття біопсійного матеріалу не відзначено клінічних ознак інфікування. Жоден з пацієнтів не мав діабетичного анамнезу, не приймав антибіотики, глюкокортикостероїди або хіміотерапевтичні препарати. Дослідження проводилися на добровольцях відповідно до положень про біоетику.
2.2. Клітинні культури
2.2.1. Культура фібробластів хронічного виразкового дефекту
Біоптати були отримані з крайових неепітелізованих частин виразкових дефектів. Клітинну культуру готували методом експлантатів. Зразки тканин багаторазово промивалися в розчині Хенкса (Біолот, Росія), потім замочувалися на 24 години у середовищі Ігла (Біолот, Росія) з антибіотиками (пеніцилін 2500 МО в мл, стрептоміцин 2,5 мг у мл). Дані маніпуляції проводилися не пізніше 4 годин після забору. Зразки подрібнювалися до розмірів приблизно 1 мм2 і вміщувалися в культуральні флакони 25 см2 (Сostar, США) у середовище Ігла з умістом 10% ембріональної телячої сироватки (FBS) (Біолот, Росія). Зміна середовища проводилася кожні 3-4 доби культивування. Після візуальної оцінки можливості перенесення мігруючих й/або проліферуючих клітин по щільності клітин навколо експлантата, ФХВД знімалися з культурального флакону з використанням трипсин / ЕДТА - суміші (Sigma, США) у співвідношенні 0,05% : 0,02% у ФСБ (рН=7,4) і застосовувалися для проведення експериментів.
2.2.2. Культура фетальних фібробластів (ФФ)
ФФ людини виділяли з абортивного матеріалу, отриманого в ході планових операцій з переривання вагітності при строках гестації 6-8 тижнів. Відокремлення фібробластів здійснювали шляхом східчастої трипсинізації 0,25% розчином трипсину (Інститут поліомієлітів і вірусних енцефалітів, Москва) фрагментів шкірно-м'язової тканини ембріона при температурі 37?С. Інгібування трипсину виконували сироваткою великої рогатої худоби ("Біолот", Санкт-Петербург). Культивування проводили з використанням живильного середовища Ігда з умістом 10% ембріональної телячої сироватки в CO2-інкубаторі при 37оС і 5 % CO2. Пасирування проводилося з використанням трипсин / ЕДТА - суміші у співвідношенні 0,05%: 0,02% у ФСБ (рн=7,4). Коефіцієнт пасирування становив 1:2.
2.2.3. Культура фібробластів здорової шкіри (ФЗШ)
Культуру ФЗШ одержували методом експлантатів з біоптатів, отриманих у ході планових операцій грижосічення з приводу вентральних гриж в 10 пацієнтів віком від 45 до 56 років. Культивування проводили з використанням живильного середовища Ігла з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки в CO2-інкубаторі при 37оС і 5 % CO2. Пасирування проводилося з використанням трипсин / ЕДТА - суміші у співвідношенні 0,05%: 0,02% у ФСБ (рН=7,4). Коефіцієнт пасирування дорівнював 1:2.
Мікроскопічний контроль культивування здійснювався за допомогою інвертованого мікроскопа LEICA DM IL і системи відеодокументації зображення LEICA QWin500 Standart (Germany), Version 2.3, Serial Nr: 3069.
2.2.4. Мікс-культура фетальних фібробластів і фібробластів хронічного виразкового дефекту (mix-культура)
Для проведення МТТ-аналізу: ФФ 5-го пасажу змішували з ФХВД у співвідношенні 1:2. Спільне культивування проводили протягом 5-ти діб із використанням 5 ліній культур ФХВД та 5 ліній культур ФФ.
Для фарбування вітальними барвниками та мікроскопії: ФФ 5-го пасажу, попередньо пофарбовані барвником РКН67 Green (Sigma, США), змішували з попередньо пофарбованими ФХВД барвником РКН26 Red (Sigma, США) у співвідношенні 1:2. Фарбування вітальними барвниками клітинних культур проводилося відповідно до інструкції фірми-виробника Sigma-Aldrich (США). Далі культивування проводили в культуральних флаконах 25 см2 за стандартною методикою, оцінку ступеня проліферації проводили візуально з використанням флуоресценції на мікроскопах LEICA DM IL і LEICA DM LS, фотодокументування результатів виконували за допомогою програми IM50 Version 1.20, Release 19, System Nr: 2083, License Nr: DN0185 і програми Leica QWin Standart.
2.3. Кількісний аналіз проліферативної активності культур з використанням диметиліазол-дифенілтетразолію броміду (МТТ-аналіз)
Для порівняння динаміки росту й проліферації культур клітин ФФ, ФЗШ і ФХВД, був проведений МТТ-аналіз клітинної проліферації (MTT-Cell Proliferation Assay). Це кількісний колориметричний аналіз для виміру клітинної проліферації, життєздатності й цитотоксичності, що базується на перетворенні солі тетразолію, МТТ ((methylthіazoletetrazolіum, 3-[4,5-диметиліазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразолію броміду) у нерозчинні у воді темно-сині кристали формазану. Таке перетворення можливе тільки в живих клітинах за присутності мітохондріального ферменту сукцинат-дегідрогенази [20]. Нерозчинний у воді формазан може бути візуалізований за допомогою ізопропанолу або іншого органічного розчинника. Оптична густина рідини виміряється спектрофотометрично, визначаючи поглинання як функцію від концентрації перетвореного барвника, кількість якого прямопропорційно залежить від кількості метаболічно активних клітин у культурі.
В експерименті використовувався барвник МТТ (Sigma, США), ізопропанол (Merck, Німеччина). Сукупне культивування ФХВД і ФФ проводилося в 24-ямкових полістиролових планшетах (Costar, США) в 5-ти серіях, оптична густина отриманого розчину вимірялася з використанням фотометра для багатофункціонального аналізу Synergy HT Bio-Tek(r) Instruments (США) за допомогою програми КС4