Розділ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкт дослідження
Об'єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів щурів. Для отримання клітин печінки були використані статевозрілі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г, що утримувалися на стандартному раціоні віварію. При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.
2.2. Виділення гепатоцитів
Виділення гепатоцитів проводили в стерильних умовах за методом Сеглена з деякими модифікаціями [10, 134]. Тварин наркотизували нембуталом (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно) та вводили гепарин (100 од.) в хвостову вену. Далі здійснювали двохетапну перфузію печінки через нижню полу вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса (7-10 хв.), що містив 9 ммоль/л HEPES і 0,5 ммоль/л EГTA, після чого продовжували перфузію 0,05 % розчином колагенази (Sigma, тип 1А) в розчині Хенкса з 9 ммоль/л HEPES і 5 ммоль/л CaCl2 (рН 7,4; 37оС) протягом 25-30 хвилин до з'явлення ознак диспергування тканини печінки.
Печінку переносили в середовище виділення (розчин Хенкса), капсулу печінки розривали. Отриману суспензію фільтрували, клітини, що виділялися, розділяли за допомогою диференційного центрифугування, осаджуючи паренхіматозні клітини двічі протягом 30 сек при 280 g. Додатково гепатоцити очищали центрифугуванням в дискретному градієнті густини Перколу (Sigma, USA) в концентраціях 73%, 57%, 30% протягом 30 хвилин при 750 g (20оС). Очищені гепатоцити збирали на межі розділу між 73 % і 57 % розчином Перколу.
Гепатоцити відмивали від Перколу за допомогою центрифугування в середовищі виділення та ресуспендували в середовищі інкубації - RPMI 1640 (Sigma) з 15 ммоль/л HEPES та 10% ембріональної телячої сироватки, інактивованої при 56оС протягом 30 хв.
2.3. Морфологічна оцінка культивованих гепатоцитів
Після виділення клітин з печінки проводили морфологічну оцінку кількості живих гепатоцитів методом виключення барвника - трипанового синього (0,2% розчин на 0,9% NaCl) [15]. Підрахунок живих та мертвих клітин проводили в камері Горяєва. Кількість живих гепатоцитів складала перед посадкою 84,6±5,6%. Ступінь очищення одержаної фракції гепатоцитів від непаренхіматозних клітин оцінювали за допомогою підрахунку гепатоцитів та НПК, клітини диференціювали за розмірами та морфологічними ознаками.
2.4. Культивування клітин та хід експерименту
Культивування проводили в 24-лункових планшетах для культур клітин ("Sigma", США) на покритому колагеном склі, або в 6-лункових планшетах, дно яких покривали полі-L-лізіном, в залежності від схеми експерименту. Гепатоцити вносили в кількості 1,5*105 клітин на лунку 24-лункового планшета в 0.6 мл середовища культивування (RPMI 1640, забуференого 15 ммоль/л HEPES, з додаванням 10 % ембріональної телячої сироватки, 10 -7 моль/л інсуліну та антибіотиків), або в кількості 2*106 клітин на лунку 6-лункового планшета в 2 мл культурального середовища. Через 3 години після посадки культури відмивали від неприкріплених клітин. Після 18-годинного культивування моношар гепатоцитів відмивали, вносили середовище інкубації (RPMI 1640 без сироватки і інсуліну) та здійснювали відповідні для різних серій експериментів впливи.
1 серія -екзогенний ТхВ2 ("Sigma", США), вносили в культури двічи з інтервалом одну годину в кінцевих концентраціях - 0,001, 0,01, 0,1 і 1 мкмоль/л.
2 серія - СС14 (попередньо розчинений в диметилсульфоксиді -ДМСО, 10 мкл СС14 на 100 мкл ДМСО) вносили в культури в кінцевій концентрації 10 ммоль/л. Екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу СС14 і через 30 хвилин після нього.
3 серія - ХДХК вносили в культури в кінцевій концентрації 100мкмоль/л; екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу ХДХК і через 30 хвилин після нього.
4 серія - в культуральне середовище вносили блокатори: загальний блокатор циклооксигенази - ацетилсаліцилову кислоту (АСК) в кінцевій концентрації 200 мкмоль/л і блокатор тромбоксансинтетази - бензилімідазол (БІА) в кінцевій концентрації 20 мкмоль/л. Через 15 хвилин додавали СС14 (10 ммоль/л) або ХДХК (100мкмоль/л).
5 серія - в культуральне середовище гепатоцитів вносили блокатор утворення мітохондріальних пор циклоспорин А в кінцевій концентрації 1 мкмоль/л, через 15 хвилин після впливу - Тх В2 в кінцевій концентрації 0,1 мкмоль/л.
Контролем для кожної концентрації Тх слугували культури, оброблені етанолом в концентрації, що дорівнювала такій в відповідному розчині ТхВ2.
2.5. Оцінка апоптозу та некрозу в культурах гепатоцитів щурів методом прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками
Культури клітин прижиттєво забарвлювали розчином ядерних барвників Хехст 33342 ("Sigma", США) та пропідіум йодид ("Sigma", США) [139]. Метод дає можливість диференціювати ядра живих, некротичних та апоптотичних клітин. Барвник йодид пропідіума проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами (некроз) і забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає як через ушкоджені мембрани, так і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин в зелено-синій колір. Зв'язані з хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні риси ядерного матеріалу, притаманні апоптозу: периферичне розташування хроматину, його конденсацію, фрагментацію ядер, а також розпад гепатоцитів на апоптотичні тільця.
Для проведення забарвлення гепатоцити відмивали від середовища культивування забуференим фосфатами фізіологічним розчином (ЗФФР, рН 7,4). Клітини інкубували 10 хв в темряві при кімнатній температурі в присутності ядерних барвників Хехст 33342 та пропідіум йодид в кінцевій концентрації 10 мкмоль/л. Барвники готували на ЗФФР з вихідних 700 мкмоль/л розчинів. Забарвлені клітини відмивали розчином ЗФФР чотири рази. Гепатоцити фіксували забуференим фос