РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Постановка эксперимента
Работа выполнена на 102 крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, возрастом 3-4 месяца, разведенных в виварии Харьковского государственного медицинского университета. Крысы наиболее часто используются для моделирования воспалительных процессов. Животных удерживали на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде по 6 штук в стандартных металлических клетках в одинаковых условиях. Для устранения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные эксперименты были проведены в осенне-зимний период, в утренние часы.
В качестве модели хронического воспаления было выбрано карагиненовое асептическое гранулематозное воспаление, вызываемое по принципу предварительного создания воздушного мешка и введения в него флогогена. Для этого под кожу спины животным вводили 8 мл стерильного воздуха. Через 24 часа в полученный подкожный мешок вводили 4 мл 2% раствора ?-карагинена в изотоническом растворе NaCl [193]. Предварительно раствор карагинена стерилизовали автоклавированием при 1210 С в течение 15 мин. Все процедуры выполняли под эфирной анестезией. Сроки воспаления отсчитывали от момента введения животным раствора карагинена.
Для облучения животных использовали источник ?-излучения OB-6 (Германия) со следующими параметрами: радиоактивный изотоп - 137Cs, радиоактивность - 20 Ci, энергия фотонов - 660 кэВ. Животные были размещены на расстоянии 1.6 м от источника, так что мощность дозы облучения составляла 21 мГр/ч.
Животными были получены дозы 0.1, 0.5 и 1.0 Гр в течение 4.8, 24 и 48 часов соответственно. Доза в 0.1 Гр лежит в области т.н. малых доз (менее 0.2 Гр или 1 трек на ядро), считавшихся до недавнего времени относительно безопасными [194]. Эффекты дозы 1.0 Гр хорошо изучены при остром облучении. Доза в 0.5 Гр находится в промежуточной области.
Первая серия животных была облучена к концу 3-х суток воспаления. При этом первая группа животных была выведена из эксперимента непосредственно после облучения. Выведение второй группы животных производили на 7-е сутки воспаления.
Вторая серия животных была облучена к концу 7-х суток воспаления. При этом первая группа животных была выведена из эксперимента непосредственно после облучения. Выведение второй группы животных производили на 14-е сутки воспаления.
Выбранные сроки хронического воспалительного процесса соответствуют пикам макрофагальной (3-и сутки) и фибробластической (7-е сутки) пролиферации [193]. Известно, что пик активности Т-зависимого иммунного ответа приходится на 1-е и 3-и - 7-е сутки, Т-независимого - на 7-е - 14-е сутки [88, 89]. Полагая, что радиационная чувствительность является максимальной в эти периоды, облучение производили к этим срокам.
Контролем служили животные, у которых вызывали воспаление, но облучению не подвергали. Кроме того, 6 животных были интактными (без воспаления и облучения).
Детальное распределение животных по сериям и группам представлено в табл. 2.1.
Опыты осуществляли в соответствии с национальными "Общими этическими принципами опытов на животных" (Украина, 2001), которые согласуются с положениями "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 18.03.1986 г.).
Таблица 2.1
Распределение животных по сериям и группам
Количество животныхДоза облучения,
ГрЖивотные, облученные к 3-м суткам воспаленияЖивотные, облученные к 7-м суткам воспаленияВыведение из эксперимента сразу после облученияВыведение из эксперимента на 7-е сутки воспаленияВыведение из эксперимента сразу после облученияВыведение из эксперимента на 14-е сутки воспаления0 (контроль)66660,166660,566661,06666Всего242424244848Интактные животные - 6
Использовали минимально допустимое для статистической обработки и получения достоверных результатов общепринятое количество животных (по 6 на группу), а также минимально достаточное для достижения цели и решения задач исследования количество экспериментальных групп, то есть общее количество животных. Умерщвление животных проводили путем декапитации под эфирным наркозом.
2.2 Определение хемилюминесценции тканей тимуса и селезенки
Для определения вероятности повреждения ДНК активными формами кислорода использовали метод инициированной хемилюминесценции (ХЛ) тканей тимуса и селезенки.
Интенсивность ХЛ характеризует ход реакций свободнорадикального перекисного окисления, главным образом липидов, которое является непременным спутником биологического обмена веществ. Свечение живых тканей в области длин волн 360-820 нм определяется свободнорадикальным окислением именно липидов в присутствии молекулярного кислорода. Этот факт подтвержден многочисленными экспериментами с использованием фотоэлектронных умножителей [195]. ХЛ является следствием экзотермической реакции рекомбинации радикалов с образованием возбужденных электронных состояний. Среди химических инициаторов перекисного окисления липидов в живых системах центральное место занимают АФК: синглетный кислород, анион-радикал, супероксидный анион, перекись водорода. Они образуются в клетке в результате многочисленных ферментативных и неферментативных реакций, среди которых наиболее существенным является процесс каталитического одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Свободные формы кислорода, как известно, активно образуются как при воспалении, так и в результате радиолиза воды при действии ИИ.
Важнейшими преимуществами ХЛ как метода исследования биологических объектов является бесконтактность (информация выносится из глубины клетки, с ее мембран оптическим путем), неинвазивность, получение минимально искаженной в процессе самого исследования информации о состоянии биологического объекта. Это выгодно отличает ХЛ от большинства методов исследования биологических систем, к непременным условиям которых чаще всего о