РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Лабораторні тварини та моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведені на щурах лінії Вістар обох статей. Усі
тварини утримувались за стандартних умов віварію Одеського державного медичного
університету. Дослідження планували з врахуванням основних положень моделювання
експериментів по вивченню спадкових ефектів у ссавців [180]. У відповідності до
поставленої мети та задач дослідження експеримент було розділено на дві
частини. У першій частині досліджували вплив алкоголю на статевозрілих самців і
самок перед спарюванням. Для цього було використано 63 самці та 187 самок віком
три місяці і масою тіла 180–200г. Самок підбирали до експерименту таким чином,
щоб вони знаходились на одній стадії естрального циклу, останню визначили за
допомогою мазків із піхви [200].
Алкоголізація тварин проводилась за методом вільного вибору з використанням 5 %
водного розчину алкоголю і води [194], який на думку більшості авторів є одним
з найбільш адекватних по відтворенню алкогольної хвороби. Тварин розміщували в
індивідуальних клітках розмірами 20х30х15 см, які були оснащені мірними
поїлками з 5 % водним розчином спирту та водою, котрі кожний день міняли
місцями. Кожний день визначали кількість алкоголю та води, які вживались
тваринами. Пристрасть до алкоголю вважали набутою тоді, коли тварини стабільно
віддавали перевагу водному розчину алкоголю, і його добове вживання не
підлягало різким коливанням. Для виявлення синдрому абстиненції щурів через 2,5
місяці позбавляли спирту на 7 днів, після чого вони знову мали змогу вільно
вибирати між алкоголем і водою. Проводили оцінку поведінкових реакцій на
протязі деприваційного періоду і визначали кількість вжитого алкоголю по
відношенню до алкоголізації. Відбір самок для запліднення та визначення першого
дня вагітності проводили за методиками отримання тварин з точно датованим
терміном вагітності [201, 202].
Друга частина експерименту була проведена на поколінні щурів самців і самок,
отриманих від алкоголізованих перед спарюванням статевозрілих тварин. З
отриманих нащадків за віковим цензом сформовано наступні групи щурів: 1)
1-місячні; 2) 2-місячні; 3) 6-місячні; 4) 12-місячні, 5) 24-місячні. Кожній
експериментальній групі тварин відповідали інтактні тварини одного віку. Щурів
забивали під ефірним наркозом шляхом декапітації. Кров збирали до попередньо
оброблених гепарином мірних пробірок. Після розтину черевної порожнини вилучали
печінку і занурювали її до охолодженого фізіологічного розчину, тричі
промивали, після чого роздрібнювали охолодженими ножицями і гомогенізували в
0,14моль розчині HCl рН 7,4. Отриманий гомогенат використовували для проведення
біохімічних досліджень.
2.2. Клінічна характеристика пацієнтів з алкогольною хворобою печінки
Під час виконання дисертаційної роботи було обстежено 60 осіб з алкогольною
хворобою печінки та 40 донорів у віці від 30 до 60 років.
Основними клінічними ознаками були наявність жовтяниці, гепатомегалія, у деяких
випадках вона виявлялась надмірною, з наявністю щільного нижнього краю органа.
У таких хворих виявлялась також спленомегалія, симптоми портальної
гіпертензії.
При біохімічних дослідженнях виявлялось збільшення вмісту білірубіну,
підвищення активності АсАТ та АлАТ, слід зауважити, що активність АСТ була у
декілька разів вища ніж АЛТ. Підвищеною також була активність лужної фосфатази.
Спостерігалось також збільшення протромбінового часу, тромбоцитопенія,
гіпергамаглобулінемія, гіпоальбумінемія. Зростала швидкість осідання
еритроцитів, макроцитоз еритроцитів, незначний лейкоцитоз, виявлялась
гіперурекемія, різко знижувався вміст б-фетопротеїну. Сироваткові маркери
вірусів гепатиту В і С були в усіх випадках негативні та методом ланцюгової
полімеразної реакції HBV DNA та HCV RNA не виявлені.
Під час езофагогастродуоденоскопії у більшості випадків виявлявся ерозивний
гастрит та езофагіт нижньої третини стравоходу. УЗД органів черевної порожнини
у більшості випадків дозволило виявити сплено- і гепатомегалію, розширені
судини системи ворітної вени.
При надходженні до стаціонару у цих хворих були скарги на слабкість, втрату
апетиту, схуднення.
Із анамнестичних даних встановлено, що більшість обстежених вживали на протязі
10-15 років щоденно алкоголь у загрозливих дозах (більше 40 г етанолу).
2.3. Методи досліджень
У печінці та крові експериментальних тварин та у крові хворих на алкогольну
хворобу печінки проводили дослідження процесів перекисного окиснення ліпідів,
стану антиоксидантної системи та цитокінової ланки імунної системи. Враховуючи
той факт, що в нашому експерименті були використані тканини ембріонів, нами
застосовувалась мікромодифікація зазначених методик [83, 195].
Для визначення вмісту дієнових кон’югатів брали 0,2 мл досліджуваного зразка,
потім вносили 2 мл суміші гексан – ізопропанол. Герметично закриті пробірки
спочатку інтенсивно струшували впродовж 15 хв. Отриманий супернатант вносили до
чистих скляних пробірок та додавали 0,5 мл 0,1N HCl і 1 мл гексану, струшували
і залишали на 30 хв. для розшарування доз. Відібравши верхній гексанмісткий
шар, вимірювали оптичну густину при довжині хвилі 233 нм в 1 см3 кюветі на
спектрофотометрі “СФ-46”. Розрахунки проводили на основі закону
Бугера-Ламбергерта-Бера [203].
Е233 = е • с • 1; с = Е233 / е • 1, (2.1)
де е = 2,20 • 105 – см –1 • моль –1 – молярний коефіцієнт оптичної густини для
дієнових кон’югатів;
Е233 – оптична густина досліджуваного розчину;
с – вміст дієнових кон’югатів;
1 – довжина оптичного шляху.
При визначенні вмісту малонового діальдегіду до 0,4 мл гомогенату додавали 0,8
мл дистил
- Київ+380960830922