РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Виділення ізольованих нейронів заднього рогу спинного мозку щурів
Експерименти проводились на гостроізольованих нейронах заднього рогу спинного мозку 11-денних щурів (Wistar). Використовувалась модифікована методика виділення М. Рандич та співавторів [182]. Тварини анестезувались ефіром до стану глибокої анестезії. Після цього проводилась операція з відсікання дужок хребців та вскриття оболонок спинного мозку. Поперековий відділ спинного мозку (L3 - L8) видалявся та одразу ж переміщувався до охолодженого (до 4?С) інкубаційного розчину, що постійно оксигенувався сумішю 5% CO2 + 95% O2, та в якому проводились всі операції, пов'язані з виділенням. Після видалення оболонок, спинний мозок прикріплювався до предметного столику вібратому (Campden Instruments LTD, Велика Британія), де проводилось нарізання його тонких поперечних зрізів (300 мкМ). Зрізи витримувались на протязі 30-40 хвилин у інкубаційному розчині, що постійно оксигенувався при температурі 35?С. Потім ділянка заднього рогу вирізалась з поперечного зрізу та піддавалась ферментативній обробці [183]. Ферметація відбувалась у розчині (0,2 мг/мл) пронази (Pronase, Calbiochem, San Diego, США) на протязі 12 хвилин та у розчині (0,05 мг/мл) протеази (Рrotease, Sigma, тип X) на протязі 10 хвилин. Після ферментативної обробки тканини заднього рогу спинного мозку переносились на покрівні скельця, заздалегідь оброблені полі-L-лізіном, обережно піпетувались шістьмома пастерівськими піпетками (найменший діаметр-150 мкм), a клітини залишались для прикріплення на протязі 35 хвилин. Після цього клітини завантажувались флуоресцентним кальцій-чутливим зондом Індо-1/АМ та переміщувались до експериментальної камери для подальших досліджень.
Експерименти з тваринами були затверджені та проводились у відповідності до вимог Клінікі піддослідних тварин Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.
2.2. Флуоресцентна кальційметрія
2.2.1. Характеристики кальцієвого зонду
Для дослідження змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію у вторинних сенсорних нейронах заднього рогу спинного мозку в якості кальцієвого індикатора був використаний зонд (барвник) Indo-1. Хімічна формула С32Н26К5N3O12. Найбільш важливими характеристиками кальцієвого зонду, що визначають його придатність до вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію, є константа дисоціації та стехіометрія зв'язування барвника з кальцієм. Константи дисоціації флуоресцентних кальційчутливих зондів знаходяться у діапазоні 100-300 нМ, що забезпечує достатньо точне вимірювання концентрації кальцію від 10 нМ до 2 мкМ. Саме у цих межах відбуваються фізіологічні зміни внутрішньоклітинної концентрації кальцію у нервових клітинах. Для Indo-1 характерна стехіометрія 1:1, що значно полегшує обчислення концентрації кальцію за результатами вимірювання флуоресценції зонду. Максимально можлива швидкість змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію, яка може бути зареєстрована зондом без викривлень, визначається швидкістю його дії. Період врівноваження Indo-1 з кальцієм коливається в межах 10-30 мсек, що дозволяє достатньо коректно реєструвати транзієнтні зміни його внутрішньоклітинної концентрації. Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію за допомогою Indo-1 передбачає двохвильову реєстрацію флуоресценції при однохвильовому збудженні. Зонд Indo-1 у водному розчині являє собою п'ятизарядний аніон, який практично не проникає до клітини через плазматичну мембрану. У зарядженій формі його можна ввести до клітини шляхом діалізу чи іонофорезу. Для завантаження зонду Indo-1 у недіалізовані клітини використовують його мембранопроникну ацетоксиметильну форму Indo-1/АМ (рис. 2.1). Ацетоксиметильний ефір флуоресцентного барвника добре розчиняється у ліпідах та легко проникає через плазматичну мембрану.
Рис. 2.1 Молекулярна формула кальцієвого зонду Indo-1/AM.
У клітині цей ефір розкладається ендогенними естеразами до формальдегіду та вільної (зарядженої) форми барвника. Існує небезпека неточного вимірювання концентрації внутрішньоклітинного кальцію при неповній деестеріфікації барвника у зв'язку з сумацією флуоресценції кальційчутливої (зарядженої) форми зонду та нечутливої до кальцію його ацетоксиметильної форми. Однак максимум спектру флуоресценції Indo-1/АМ співпадає з ізобестичною точкою спектру Indo-1 (близько 450 нм) (рис. 2.2). Це дає можливість навіть при неповній деестеріфікации ацетоксиметильної форми зонду визначати внутрішньоклітинну
Рис. 2.2. Спектр флуоресцентної емісії зонду Indo-1.
На вісі Х відкладена довжина хвилі (у нМ), на вісі Y - інтенсивність випромінення. Концентрація іонів кальцію змінюється від 0 до 39,8 мкМ. Довжина збуджуючої хвилі дорівнює 339 нм.
концентрацію кальцію шляхом вимірювання флуоресцентного сигналу Indo-1 на хвилях довжиною 395 та 495 нм.
2.2.2. Метод завантаження клітин флуоресцентним зондом
У експериментах на недіалізованих клітинах ми використовували мембранопроникну форму барвника (Indo-1/АМ). Ацетоксиметильний ефір Indo-1 є практично нерозчинним у воді,
тому спочатку готували 1 ммоль/л маточний розчин барвника у діметилсульфоксиді. Розчин зберігався у замороженому вигляді на протязі декількох місяців без погіршення властивостей кальцієвого індикатору. Перед експериментом до 1 мл розчину Тироде додавали 10 мкл маточного розчину Indo-1/АМ та 10 мкл 25% діметилсульфоксидного розчину плюроніка (Pluronic-127, Molecular Probes Inc., США) та перемішували за допомогою мікрошейкеру. Кінцева концентрація Indo-1/АМ у розчині Тироде складала 10 мкМ. Неіонний детергент Pluronic-127 забезпечував підтримання гідрофобних молекул Indo-1/АМ у вигляді мікродисперсної емульсії, що прискорювало проникнення барвника до клітини. Розчин, що містив Indo-1/АМ, заливали до чашки Петрі з прикріпленими до дна клітинами та витримували їх у термостаті при 37?С на протязі 30-40 хвилин. Після цього клітин