РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні тварини
У дослідженнях, присвячених механізмам розвитку посттравматичних порушень
діяльності мозку, oб’єктoм дослідження, що найчастіше застосовується, є мозок
щура [15, 62, 75, 127, 133, 157, 191]. Основні закономірності виникнення і
розвитку наслідків ЧМТ, механізмів їх приглушення, установлені на даному
експериментальному об'єкті, має подібний патогенетичний характер з такими, що
спостерігаються в інших видів тварин [97, 110]. Виходячи з цього, а також
ґрунтуючись на меті і завданнях дослідження, у пропонованій праці як
експериментальні тварини були обрані статевозрілі щури-самці лінії Вістар.
Робота з експериментальними тваринами проводилася відповідно до вимог,
викладених в "Міжнародних рекомендаціях із проведення медико-біологічних
досліджень з експериментальними тваринами", запропонованих Радою міжнародних
медичних організацій у 1985 р., розробленому на їх основі додатку до Наказу
Міністерства охорони здоров'я СРСР N 755 від 12.08.1977 р. "Про заходи для
подальшого удосконалювання форм роботи з використанням експериментальних
тварин", а також відповідно до зауважень, викладених у "Листі комісії з
проблеми етики ставлення до тварин" (Успіхи фізіологічних наук.- 1993.- Т.24,
N4.- С.108).
Дослідження проводилося в умовах гострого експерименту на 278 білих
щурах-самцях лінії Віcтар масою від 180 до 220 г. Тварин вміщували в
індивідуальні бокси з природною зміною світла і темряви, з вільним доступом до
води і їжі. З метою приручення щурів перед початком експерименту тримали в
руках по 2-3 хв протягом 5 днів, що полегшувало наступні експериментальні
дослідження з тваринами [13]. Дослідження проведені відповідно до вимог комісії
з біоетики ОДМУ (протокол №7 А від 17.11.2006р).
2.2. Модель ЧМТ
ЧМТ у щурів відтворювали шляхом впливу падаючого грума масою 30 г з висоти 50
см на тім'яну частину черепа щура, якого в умовах ефірного рауш-наркозу
фіксували таким чином, що траєкторія падіння вантажу була перпендикулярною до
поверхні черепа тварини [61, 97]. У подібних умовах у тварини спостерігалися
порушення, що класифікували відповідно до їх тяжкості на три групи [61].
1) Легкий ступінь тяжкості – у тварин відбувалося порушення координації і пози,
що зберігалися протягом перших двох годин з моменту механічної травми, після
чого реєструвалося поступове відновлення рухової активності (10-15% усіх
щурів);
2) ЧМТ середнього ступеня тяжкості- пізно-тонічні порушення зберігалися
протягом чотирьох годин спостереження, але протягом цього періоду відзначалося
відновлення короткочасних дискоординованих локомторних актів (70-80% усіх
тварин);
3) ЧМТ тяжкого ступеня характеризувалася відсутністю відновлення вертикальної
пози тварин, вираженими вегетативними порушеннями і слабими рефлексами на
защипуванні хвоста і при доторканні до роговиці ока (10-15% усіх тварин).
Оцінку рухової активності здійснювали методом «відкритого поля» [3, 34], а
також методом прямої актометрії [31]. Перед початком дослідження щура поміщали
в скляний конус і через 30 сек плавно випускали в центр “відкритого поля” чи на
рухливу підлогу актометра, де враховували рухову активність тварини протягом 2
хв. У «відкритому полі» визначали горизонтальну рухову активність - число
перетнутих квадратів.
Як групу контролю спостерігали інтактні тварини, яких короткочасно в умовах
ефірного рауш-наркозу фіксували без здійснення механічного удару.
2.3. Моделі епілептичної активності
2.3.1. Ф а р м а к o л o г і ч н и й к і н д л і н г. Для здійснення
фармакологічного кіндлінгу тваринам робили 20-24 щоденні однократні
внутріочеревинні (в/очер) уведення підпорогових доз пікротоксину (1,0-1,2
мг/кг) [27, 32, 33, 137]. Пікротоксин викликає ефект, зв'язуючись з
бензодіазепін-ГАМК-іонофорним комплексом, блокуючи хлорний канал рецепторів
ГАМК і порушуючи тим самим ГАМК-ергічний гальмувальний контроль [195].
Важливою особливістю пікротоксин-індукованого кіндлінгового судомного синдрому
є його подібність до абсансних проявів епілепсії на ранньому етапі розвитку
[62]. Тому дана модель і, зокрема, рання фаза кіндлінгу дозволяє досліджувати
патогенетичні механізми, що знаходяться в основі абсансної форми епілепсії.
Епілептоген вводили в об’ємі 0,10-0,20 мл в однакових умовах (у той самий час
доби, у лабораторії з однаковою освітленістю, вологістю, температурою і шумовим
фоном). Після ін'єкції конвульсанта щурів поміщали в індивідуальні прозорі
пластмасові камери (10 см х 25 см х 30 см) і спостерігали протягом 60 хв.
Тваринам контрольних груп в аналогічних умовах вводили однакову кількість 0,9%
фізіологічного розчину NаСl (рн=7.4).
Інтенсивність судомних реакцій моделі пікротоксинового кіндлінгу визначали
візуально й оцінювали таким чином: 0 балів - відсутність судомної реакції; 1
бал - міоклонічні здригування голови чи тулуба; 2 бали - клонічні судоми м'язів
тулуба і кінцівок; 3 бали - підйом на задні кінцівки ("поза кенгуру"), повторні
клонуси м'язів передніх кінцівок; 4 бали - генералізовані клоніко-тонічні
судоми c падінням тварин на бік, вегетативними розладами і постнападною
депресією; 5 балів - смертельні судоми або повторні генералізовані
клоніко-тонічні напади [32, 33].
2.3.2. В о г н и щ е в а і в т о р и н н о - г е н е р а л і з о в а н а е п і
л е п т и ч н а а к т и в н і с т ь. Створення вогнищ епілептогенезу шляхом
впливу епілептогенів, що мають різні механізмами нейрохімічної дії, дає
можливість оцінити стан ряду нейромедіаторних систем при різних функціональних
станах мозку [16, 62]. Зокрема, дана методика дозволила п
- Київ+380960830922