РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Вибір й умови утримання експериментальних тварин
Дослідження виконане на 136 щурах самцях лінії Вістар вихідною масою 195±15 г.
Тварини утримувалися в умовах віварію на стандартному раціоні зі стабільним
змістом натрію й при вільному доступі до води. Підготовка тварин до
експериментів, всі інвазивні втручання, знеболювання й виведення з експерименту
здійснювалися з дотриманням відповідних вимог Європейської Конвенції по захисту
хребетних тварин. Щурів виводили з експерименту в вранці між 9.00 й 10.00
годинами в спеціальному приміщенні при температурі 18-22° С, відносній
вологості 40-60% й освітленості 250 люкс шляхом декапітації.
2.2. Розподіл тварин на експериментальні групи
Розподіл на групи проводили до моделювання ЦД на підставі оцінки базальної і
резервної потужності eNOS, що є основним джерелом оксиду азоту й формує систему
адаптаційного захисту ендотелію до дії патогенетичних факторів ЦД. Вибір даного
підходу був пов'язаний з наявністю даних про індивідуальні особливості
генетично детермінованої експресії ферменту [15, 190]. Останнє визначає
ефективність реалізації компенсаторної реакції при дії патогенетичних факторів
ЦД, тоді як низька експресія ферменту може призвести до розвитку ендотеліальної
дисфункції й органних ускладнень ЦД [38, 44, 101].
В якості об'єкту вивчення активності eNOS використовували тромбоцити. Даний
вибір був мотивований широкою експресією на поверхні даних формених елементів
рецепторів до ключових вазомоторних регуляторів, тісною функціональною
спряженістю тромбоцитів й ендотелію, а також високою експресією eNOS [6, 105].
Для оцінки стану базальної й резервної потужності ферменту використовували
інгібиторний аналіз, який заснований на оцінці модулюючих ефектів стимулятора й
інгібітору eNOS на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів [8, 9]. Ефект L-NAME
відбивав базальну активність ферменту й не розрізнявся статистично значимо у
експериментальних тварин. Додавання L-аргініну в суспензію тромбоцитів,
преінкубованих з АДФ, дозволяло судити про резервну потужність eNOS, причому
даний ефект відрізнявся вираженою індивідуальною гетерогенністю. На підставі
аналізу характеру розподілу параметрів агрегації тромбоцитів при їхній
інкубації з L-аргініном до моделювання алоксанового діабету піддослідних тварин
розділили на дві групи: з нормальною (індукована АТ знижувалася на 15-20%) і
зниженою (індукована АТ змінювалася на 5-8%) резервною потужністю eNOS.
Контроль нормальності розподілу показника індукованої АТ у межах кожної групи
проводили на підставі критерію c2.
З отриманої вибірки в межах кожної групи випадковим методом відібрали по 10
щурів, які утворили групи контролю для різних типів реактивності за показником
резервною потужності eNOS (нормо- і гіпореактивних). Із групи тварин з
нормальною резервною потужністю eNOS для моделювання ЦД 1-го типу відібрали 40
щурів, що сформували 1-у групу (нормореактивні тварини). Щурів з низькою
резервною експресією eNOS (n=76) розділили на дві групи. Гіпореактивні щури,
які після моделювання ЦД не одержували якої-небудь фармакологічної корекції,
склали 2-гу групу (n=40). Інші 36 щурів віднесли до 3-ї групи, у якій
використався рубоксістаурин - інгібітор протеїнкінази С. Препарат додавали в
питну воду в дозі 32 мг/кг, що по даним [102, 114] відповідає IC50 – інгібуючій
концентрації, яка викликає 50% зниження активності ферменту. Тварини
утримувалися в індивідуальних клітках з автопоїлками, що дозволяло контролювати
споживання препарату.
Таблиця 2.1
Розподіл і характеристика експериментальних тварин
Групи
Агрегація тромбоцитів
М±s
Модулюючий ефект
L-NAME
Амплітуда ефекту L-аргініну
1-а група
(n=50)
17,9±4,5%
18,4±3,7%
2-3 група
(n=86)
16,6±4,3
6,26±2,6**
Примітка. ** - демонструє вірогідність відмінностей у порівнянні з
нормореактивними щурами (1 група) - p<0,01.
Інгібітор ПкС призначали через 2 тижні після введення алоксану при наявності
гіперглікемії, яка свідчила про розвиток інсулярної недостатності.
2.3. Моделювання цукрового діабету
Цукровий діабет 1-го типу моделювали натще (через 16 годин після останнього
годування) шляхом ін'єкції у хвостову вену алоксану з розрахунку 16 мг/кг маси
тіла [48]. Ін'єкції виконували під легким ефірним наркозом, навесні вранці між
8.00 й 10.00 годинами.
Підтвердженням розвитку інсулярної недостатності вважали підвищення рівня
глюкози в крові в межах 12-24 ммоль/л на 14-у добу експерименту [13, 55]. Масу
тіла тварин, рівень глікемії й глюкозурії вимірювали до початку експерименту,
через 14 діб, 1, 2 й 3 місяці після введення алоксану. У ці ж строки проводили
аналіз стану систем внутрішньоклітинної сигналізації, а також структури й
функції нирок.
2.4. Дослідження in vitro стану систем внутрішньоклітинної сигналізації,
асоційованих з eNOS-протеїнкіназа G
Тромбоцити виділяли з периферичної крові тварин, взятої із хвостової вени. Кров
збирали в пластикові пробірки, що містять кислий цитратдекстрозний
антикоагулянт у співвідношенні його із кров'ю 1:6. Центрифугування крові
проводили 15 хв при 200 g для одержання збагаченої тромбоцитами плазми. Потім
проводили подальше центрифугування протягом 10 хв при 2000 g, у результаті чого
одержували плазму, збіднену тромбоцитами. Її використали для підтримки
стандартної кількості клітин на рівні 200 тис/мкл [9]. Відмиті тромбоцити
суспендували в буферному розчині, що містив (мкМ): NaCl (138), KCl (3), MgCl2
(1), глюкоза (10), HEPES (10), Na2PO4 (0,37), p 7,4 [8].
Інгібіторний аналіз базувався на оцінці індукованої in vitro агрегації
тромбоцитів (АТ). В якості
- Київ+380960830922