РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Матеріал дослідження
Експерименти проведено на 229 білих нелінійних щурах-самцях, яких утримували в
звичайних умовах та на стандартному рацiонi вiварiю. Кожна експериментальна
група нараховувала 6-10 тварин. Адреналінову міокардіодистрофію (АМД)
моделювали шляхом одноразового внутрішньочеревного введення 0,18 % розчину
адреналіну гідротартрату (“Дарниця”, Україна) з розрахунку 0,5 мг/кг маси тіла
[211].
Експерименти проводили на щурах таких вікових періодів: дорослі (8-10 місячні,
маса 180-220 г) та старі (18-24 місячні, масою 300 г і більше). Було проведено
три серії дослідів. У щурів з першої серії експерименту забирали кров для
визначення показників гуморального імунітету, фагоцитозу та ендогенної
інтоксикації, а також серця для гістологічного та електронномікроскопічного
досліджень. В наступній серії дослідів у тварин реєстрували електрокардіограму,
а біологічний матеріал – серце і кров піддавали біохімічному дослідженню для
визначення показників пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидної системи,
активності енергозабезпечувальних ферментів та трансаміназ. Макроморфометрія
серця щурів проводилась в самостійній серії експерименту. Декапітацію в умовах
тіопентал-натрієвого знеболювання здійснювали через 1, 3 (період розвитку
максимальних порушень), 7 та 14 (період зменшення ушкоджень, віддалені терміни
АМД) діб після ін’єкції адреналіну [81, 191, 211, 296]. Матеріалами дослідження
були плазма крові, сироватка крові, цільна кров, гомогенати серця та серця
тварин.
Кров забирали у дві пробірки, попередньо додавши на дно однієї з них 5 % розчин
цитрату натрію. Для отримання сироватки цільну кров центрифугували при 3000
об./хв протягом 20 хв. Вийняте з грудної клітки серце відмивали від крові у
фізіологічному розчині натрію хлориду, висушували фільтрувальним папером і
подрібнювали ножицями на дрібні шматки. Всі маніпуляції проводили при
охолодженні, витримуючи температуру 0 – +4 єС. Тканину зважували на торсійних
терезах, переносили в гомогенізатор Поттера-Ельвегейма, наливали туди
фізіологічний розчин у співвідношенні 1:10 і гомогенізували протягом 2 хв.
Одержаний гомогенат відразу досліджували.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності до Європейської конвенції з
захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і наукових
цілей (Страсбург, 1986).
2.2 Методи визначення активності процесів ПОЛ
2.2.1 Визначення вмісту ТБК-активних продуктів
Принцип методу полягає у здатності малонового діальдегіду (МДА) при взаємодії з
тіобарбітуровою кислотою (ТБК) в кислому середовищі утворювати забарвлений
комплекс, інтенсивність якого адекватна вмісту МДА. Вміст МДА визначали в
плазмі та 10 % гомогенаті серця [57].
У звичайні центрифужні пробірки наливали по 1 мл дистильованої води, 1 мл 10 %
гомогенату або 0,5 мл плазми, 2 мл 30 % р-ну трихлороцтової кислоти (ТХО), 0,2
мл 5-молярного р-ну HСl, 2 мл ТБК і витримували 15 хв на водяній бані при 100
°С. Проби охолоджували, осад відділяли центрифугуванням при 3000 об./хв. Проби
центрифугували 10 хв і вимірювали оптичну густину надосадової рідини на
спектрофотометрі СФ-46 при 535 нм проти води. Розрахунок проводили, враховуючи
коефіцієнт молярної екстинкції для МДА, який дорівнює 1,56 Ч 105 моль Ч см-1.
Концентрацію виражали в мкмоль/л у плазмі крові та мкмоль/кг в гомогенаті
серця.
2.2.2 Визначення вмісту гідропероксидів ліпідів (ГПЛ)
Концентрацію ГПЛ визначали за методом [297], який грунтується на тому, що
екстраговані гептан-ізопропіловою сумішшю гідропероксиди мають відповідний
максимум поглинання при 233 нм.
До 0,2 мл плазми або 10 % гомогенату додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу
(1:1) і струшували 15 хв на лабораторному струшувачі. Потім у пробірки додавали
по 1 мл розчину НСІ (рН=2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і після
відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий шар і
вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-46 при 233 нм. Як
контроль використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води замість
досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ГПЛ проводили у відносних одиницях
за формулою:
С= 10 Ч Е Ч V1 : V2 ум. од./ мл (для плазми) (2.1)
або С= Е Ч V1 : V2 (для серця), (2.2)
де Е – оптична густина гептанового шару проби,
V1 – кінцевий об’єм гептанового екстракту (4 мл),
V2 – об’єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
Вміст ГПЛ виражали в ум.од./л у плазмі крові та ум. од./кг в гомогенаті серця.
2.3 Дослідження стану антиоксидної системи
2.3.1 Визначення активності супероксиддисмутази
Активність СОД визначали за відомим методом [298] у модифікації [299]. В основі
методу лежить здатність СОД конкурувати з нітротетразолієм синім за
супероксидні аніони, які утворюються в результаті взаємодії відновленої форми
нікотинамідаденіндинуклеотиду і феназинметасульфату. В результаті цієї реакції
нітротетразолій синій відновлюється з утворенням гідразинтетразолія. В
присутності СОД відсоток відновлення нітротетразолію синього знижується.
Для досліджень брали 1 мл 10 % гомогенату серця, приготовленого на фосфатному
буфері (рН 7,4). Попередньо досліджуваний матеріал обробляли
хлороформ-спиртовою сумішшю і КН2РО4 з наступним центрифугуванням при 6000
об./хв протягом 30 хв при 4 °С. До 0,2 мл супернатанту додавали 1,3 мл
0,1-молярного фосфатного буферу (рН 8,3), 1 мл розчину нітротетразолію синього,
0,3 мл розчину феназинметасульфату і 2 мл 0,2 мМ розчину НАДН2. Проби 10 хв
витримували в темноті й фотометрували (СФ-46, 540 нм) в кюветі проти проб, до
яких не додавали НАДН2. Контролем служили проби, в яких замість гомогенату
знаходилося
- Київ+380960830922