ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные животные
Исследования проведены на 132 самцах крыс линии Вистар массой 230-250 г. Животные находились в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище. Объектом исследования у экспериментальных животных была вилочковая железа.
2.2. Серии экспериментальных исследований
Исследуемые животные были разделены на одиннадцать экспериментальных групп: интактные крысы, которые служили контролем (группа 1); крысы, подвергавшиеся гипоксическим тренировкам различной длительности - 5 (группа 2), 10 (группа 3), 15 (группа 4) и 20 (группа 5) сеансов на "высоте" 6000 м. Контрольные крысы, которым интрацеребровентрикулярно или интраперитонеально вводили физиологический раствор (группы 6 и 7); крысы, подвергавшиеся введению нейропептидов - интрацеребровентрикулярному (группа 8) и интраперитонеальному (группа 9) введению окситоцина, интрацеребровентрикулярному (группа 10) и интраперитонеальному (группа 11) введению NPY. У всех этих животных была изучена морфофункциональная характеристика лимфоидной популяции вилочковой железы. Распределение животных в экспериментальных группах представлено в таблице 2.1.
2.3. Экспериментальные модели
2.3.1. Методика гипоксических тренировок. Гипоксические тренировки осуществляли в вентилируемой барокамере объемом 1,0 м3 при помощи широко используемой модели, описанной в работах [241,242]. При этом животные ежедневно в одно и то же время суток (с 10 до 16 часов) помещались в барокамеру. Режим гипоксических воздействий был следующим: в 1-й день напряжение О2 в барокамере соответствовало высоте 1 км, на 2-й день - 2 км, на 3-й - 3 км, на 4-й - 4 км, на 5-й - 5 км, на 6-й и в последующие дни - 6 км.
Таблица 2.1.
Распределение крыс в экспериментальных сериях
Серии исследованийКоличество
животных 1. Интактные животные (контроль) 12 2. Гипоксические тренировки (5 сеансов на 6000 м) 12 3. Гипоксические тренировки (10 сеансов на 6000 м) 12 4. Гипоксические тренировки (15 сеансов на 6000 м) 12 5. Гипоксические тренировки (20 сеансов на 6000 м) 12 6. Контроль с интрацеребровентикулярным введением физиологического раствора 12 7. Контроль с интраперитонеальным введением физиологического раствора 12 8.Интрацеребровентрикулярное
введение окситоцина 12 9.Интраперитонеальное введение окситоцина 12 10.Интрацеребровентрикуляное введение нейропептида Y 12 11.Интраперитонеальное введение нейропептида Y 12 ИТОГО 132
"Высота подъема" в барокамере регистрировалась при помощи альтиметра. Известно, что гипоксические воздействия по указанной методике на протяжении 3-4 недель приводили к значительному увеличению резистентности животных к острой гипоксии, физической нагрузке, интоксикации и другим патогенным факторам [12,243,244].
2.3.2. Методика многократного введения нейрогормонов. Для изучения влияния окситоцина и нейропептида Y на структуры вилочковой железы применялось многократное интрацеребровентрикулярное и интраперитонеальное введение их синтетических аналогов. Подбор доз для введения нейрогормонов осуществлялся на основании данных литературы [223,245,246] и исследований, проведенных на кафедре патофизиологии Запорожского медицинского университета [247,248,249,250,251]. Для введения использовались пептиды производства фирмы Peninsula Laboratories Ins., США.
Для интрацеребровентрикулярного введения нейрогормонов крысам предварительно имплантировали канюлю в правый латеральный желудочек мозга под этаминаловым наркозом (35 мг/кг внутрибрюшинно) с помощью стереотаксического аппарата THORAX (Венгрия). Животных фиксировали в положении, при котором линия резцов была на 3,3 мм ниже межушной линии. Стальную стерильную канюлю (калибр G 27) погружали в мозг по координатам нижнего среза канюли: 8,5 мм вперед межушной линии, 1,5 мм вправо от средней линии, 4,0 мм ниже крыши черепа, после чего канюлю крепили нихромовой проволокой к гребням костей черепа и фиксировали зубной быстроотвердевающей пластмассой, а верхний срез канюли закрывали стерильным колпачком. На 8-й день после операции животных отбирали в эксперимент. Нейрогормоны вводили в объеме 0,5мл водного раствора 0,9% NaCl один раз в день (с 10 до 12 часов) в течение 10 дней. Ежедневная доза нейрогормонов составляла: синтетического окситоцина - 10 нг (2,3 пмоль), нейропептида Y - 10 нг (2,3 пмоль).
Многократное интраперитонеальное введение нейрогомонов осуществляли внутрибрюшинно в течение 10 дней. Ежедневная доза вводимых гормонов составляла: для окситоцина - 2,5 мкг (0,6 нмоль), NPY - 2,5 мкг (0,6 нмоль) в 0,5 мл 0,9% NaCl. Контрольным животным этой и предыдущей серий интраперитонеально и интрацеребровентрикулярно в течение 10 дней в том же объеме вводили физиологический раствор. Экспериментальных животных в последний день исследований лишали пищи и на следующий день (после 16 часов голодания) декапитировали под наркозом (этаминал натрия 40 мг/кг внутрибрюшинно). Вилочковую железу быстро извлекали и на 20 часов помещали в фиксатор Буэна. После стандартной процедуры обезвоживания и пропитки хлороформом и парафином, железу заливали в парафин. На ротационном микроскопе готовили 5-микронные серийные срезы из различных участков вилочковой железы, фиксированной по Буэну, которые затем депарафинировали в ксилоле, проводили регидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%), отмывали в физиологическом растворе и окрашивали гематоксилин-эозином.
2.4. Методы исследования лимфоидной популяции вилочковой железы
О функциональном состоянии лимфоидных клеток вилочковой железы судили на основании изучения серийных гистологических срезов из различных отделов железы и данных морфометрических и денситометрических характеристик при окраске гематоксилином-эозином, данных иммуноцитофлюоресцентного выявления клеточных антигенных маркеров CD4,