РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Лабораторні тварини і моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведені на 210 білих щурах-самцях вагою тіла 230
– 250 г, в тому числі:
- в серії експериментів по вивченню функції нирок у інтактних щурів - 20
тварин; - в серії експериментів по вивченню впливу CCl4 на функцію нирок - 20
тварин; -в серії експериментів по вивченню впливу HgCl2 (0,1 мг/100 г від в.т.)
на функцію нирок щурів - 20 тварин; - в серії експериментів по вивченню
комбінованого впливу HgCl2 и CCl4 на функцію нирок щурів - 20 тварин; - в серії
експериментів по вивченню функції нирок у щурів на тлі введення каптоприлу - 20
тварин; - в серії експериментів по вивченню функції нирок у щурів, яким вводили
CCl4 и каптоприл - 20 тварин; - в серії експериментів по вивченню функції нирок
у щурів, яким вводили каптоприл на тлі комбінованої інтоксикації HgCl2 (0,1
мг/100 г від в.т.) і CCl4 - 20 тварин;
- в серії експериментів по вивченню впливу каптоприлу на функціональний стан
нирок білих щурів при введен CCl4 і комбінованим впливі HgCl2+CCl4.
2.2. Методи досліджень
Усі дослідження на щурах проводилися за умов індукованого діурезу [6]. Вивчали
осморегулюючу та екскреторну функцію, динаміку змін кліренсу креатиніну,
канальцевий транспорт ОАР, концентраційну здатність нирок, ступінь протеїнурії,
функціональну спроможність нирок, щодо регуляції обміну нітритів за умов
індукованого (водного та сольового) діурезу. Індукований діурез: водне
навантаження – відстояну, підігріту до 37 0С водопровідну воду вводили
внутрішньошлунково металевим зондом у об’ємі, що досягає 5% від ваги тіла
тварини.
Відразу після навантаження щурів пересаджували в обмінні клітки, де і збирали
сечу протягом наступних 2 годин. Сольове (осмотичне) навантаження:
використовували 3% розчин хімічно чистого хлориду натрію, який також вводили
внутрішньошлунково металевим зондом із розрахунку 5% від маси тіла. Сечу
збирали впродовж наступних 2 годин у метаболічних клітках. Після збору сечі
проводили евтаназію тварин шляхом швидкої декапітації під легкою ефірною
анестезією. Біохімічному дослідженню підлягали біологічні рідини організму
щурів – плазма крові та сеча. В отриманих зразках плазми крові і сечі проводили
аналіз хімічного складу за наступними методиками: загальний білок у сечі
визначали фотометрично (довжина хвилі 590 нм) на «СФ-46» („Ломо”, виробництво
Росія) сульфосаліциловим методом [26]; креатинін плазми крові і сечі визначали
також фотометрично на «СФ-46» (довжина хвилі 520 нм) за реакцією з пікриновою
кислотою [37]; осмоляльність сечі та плазми крові визначали загальноприйнятим
кріоскопічним методом на осмометрі „3Д3” (виробництво США) [37], концентрацію
нітритів, нітратів та сечовини у плазмі крові і сечі визначали фотометрично
(довжина хвилі 540 нм) за методикою, запропонованою Емченко Н.Л. и соавт.
(1994).
Креатинін сечі визначали фотометрично на спектрофотометрі СФ-46 (довжина хвилі
= 520 нм), у реакції з пікриновою кислотою [37]:
-у колбочку об'ємом 25 мл додавали 100 мкл сечі, додавали 500 мкл пікринової
кислоти і 500 мкл 10% розчину NaOH;
- інкубували при кімнатній температурі 15 хв;
- доводили дистильованою водою до мітки;
- вимір проводили проти холостої проби в кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм.
Креатинін плазми визначали фотометричним методом на СФ-46 (довжина хвилі = 520
нм), за наступною методикою [37]:
- у центрифужну пробірку відбирали 0,5 мл плазми, додавали 2,5 мл кислоти;
- центрифугували 15 хв при 3000 об\хв;
- відбирали 2 мл надосадової рідини в біохімічну пробірку, потім додавали 120
мкл 10% розчину NaOH;
- інкубували при кімнатній температурі 20 хв;
- вимір проводили проти холостої проби, у яку помістили замість проби плазми
0,5 мл дистильованої води.
Білок у сечі визначали фотометрично на СФ-46 (л = 590 нм), за реакцією з
сульфосаліциловою кислотою [26]. Концентрацію фосфатів у сечі визначали
фотометричним методом на СФ-46 (л = 670 нм), за наступною методикою [24] :
- додавали в біохімічну пробірку 50 мкл проби, додавали 1 мл молібденового
реактиву (12,5 м молибдату амонію розчиняють у 250 мл H2SO4 і доводили до 500
мл дистильованою водою), потім – 1 мл аскорбінової кислоти, приготовленої ex
tempore, далі – 2,8 мол дистильованої води;
- інкубували 30 хв у темряві при кімнатній температурі;
- вимір проводили проти холостої проби в кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм. Концентрацію фосфатів у плазмі крові визначали за наступною методикою:
- у центрифужну пробірку відбирали 200 мкл плазми крові, додавали 200 мкл 5%
розчину трихлоруксусної кислоти, центрифугували 15 хв при 3000 об\хв;
- 100 мкл надосадової рідини відбирали в біохімічну пробірку, додавали 1 мл
молібденового реактиву, 1 мл аскорбінової кислоти, потім 2,8 мол води і 30 хв
витримували в темряві, виміру проводили при л = 670 нм.
Осмоляльність плазми і сечі вимірювали криоскопічним методом на осмометрі-3D3
(вир-во США). Концентрацію нітритів плазми і сечі визначали фотометрично на
СФ-46 (л =540 нм), за наступною методикою [19]: - у центрифужну пробірку
поміщали 0,25 мл 50% розчину сульфату цинку, 0,25 мл 17% розчину феррицианиду
заліза, 1 мл сечі, ( плазми, води – для холостої проби), додавали 0,5 мл
боратного буферу, (величина рН 9,6), і 1 мл дистильованої води;
- отриману суміш перемішували і центрифугували протягом 20 хв при 3000 об/ хв;
- відбирали 1 мл надосадової рідини в біохімічну пробірку, додавали 1 мл 3%
розчину оцтової кислоти, 1 мл дистильованої води і 1 мл 4% розчину реактиву
Грісу;
- вимір проти холостої проби проводили в кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм;
- калібрований графік будували за результатами фотометричного аналізу р
- Київ+380960830922