РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Епітеліоцити одержували шляхом піхвових лаважей від 25 здорових жінок-добровольців під час профілактичних оглядів, проведених в поліклініці № 10 р. Луганська з 2005 по 2007 рр.
Лаважну рідину отримували шляхом лаважей від 58 жінок віком від 19 до 45 років (середній вік - 30,7?0,33 роки), хворих на бактеріальний вагіноз. Жінки, які приймали у останні 2 тижні, які передували огляду, антибіотики, спринцювання, піхвові душі та препарати з локальною дією, були виключені з досліджень. Обов'язковою умовою була відсутність статевого контакту у останні 72 години до обстеження. Також враховували характер професії, деякі соціально-демографічні дані, методи контрацепції та ін. Стерильним ватяним тампоном частину нативного матеріалу наносили на знежирені предметні скельця, які після підсушування на повітрі фіксували у метанолі для подальшого фарбування та мікроскопії. Після приготування мазків виконували змив редукованим фізіологічним розчином або попередньо приготованим сольовим розчином, частину якого використовували для світлової мікроскопії з метою виявлення "ключових клітин", трихомонад, псевдогіфів грибів та бактерій роду Mobiluncus. Наступним етапом виконували рН-метрію вмісту піхви у області заднього склепіння піхви за допомогою паперових смужок (рНydrion, Lyphan, США з шкалою виміру 4,3-6,1 та Merck, США, з шкалою 3,8-5,4). Амінотест (реакцію з гідроокисом калію) виконували, занурюючи маленький тампон з піхвовими виділеннями у пробірку з 10 % розчином КОН.
Робота виконувалась у відповідності до загальноприйнятих біоетичних норм з дотриманням відповідних принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції ради Європи про права людини і біомедицини та відповідних законів України відносно проведення експериментальних та клінічних досліджень. Всі пацієнтки дали згоду на обстеження та участь у випробовуваннях, цифрові результати яких увійшли до даного дисертаційного дослідження.
У піхву вводили стерильне гінекологічне дзеркало, а потім за допомогою стерильної піпетки, з'єднаної з одноразовим шприцом (об'єм - 10 мл), проводили лаваж 5 мл стерильного фосфатно-буферного розчину протягом 30 секунд. Рідину збирали в стерильну пробірку, центрифугували протягом 10 хвилин при 800 g і видаляли супернатант. Клітини, що залишилися, ресуспендували і використовували або негайно, або приміщали їх у розчин для криогенної заморозки, який складався з 50 % ембріональної телячої сироватки (Gibco, США), 35 % середовища RPMI 1640 (Gibco, США) і 15 % диметилсульфоксиду (Sigma, США) і заморожували при -70?С до використання. Результати були однаковими як при використанні свіжих клітин, так і епітеліоцитів, які заморожували.
Для виділення епітеліоцитів клітини піхви ресуспендували у 7,0 мл середовища Хенкса (Gibco, США) і розділяли на стерильних нейлонових мембранах з діаметром пір 20 µм. Епітеліоцити, які залишались на мембранах, збирали промиванням 50,0 мл середовища Хенкса в стерильні чашки Петрі. Потім клітини переносили в центрифужні пробірки об'ємом 50,0 мл і центрифугували при 800 g, після чого видаляли супернатант, і ресуспендували збагачений клітинний пул в пептонному середовищі Phytone (Becton Dickinson, США), до якого додавали 10 % фосфатно-буферний розчин та 1 % розчин пеніциліну (100 МО/мл) і стрептоміцину (100 нг/мл) (Gibco, США). Кількість епітеліоцитів підраховували при світловій мікроскопії мазків, пофарбованих трипановою синькою. Чистоту пула епітеліальних клітин (>95 %) визначали шляхом підрахунку 100 клітин в 5 різних полях зору і виражали як середній відсотковий вміст клітин з характерними для епітеліоцитів морфологічними ознаками.
У всіх дослідах використовували епітеліоцити піхви в концентрації (5,0?0,25)*5 lg клітин/мл.
2.2. Методи дослідження
ПГН одержували з клітинних стінок бактерій за методом P.K. Peterson і співавт. [126, 129]. Культури бактерій вирощували в середовищі, яке містило пептонний дріжджовий екстракт (0,5 % екстракт дріжджів, 1,3 ммоль К2НРО4, 1,1 ммоль глюкози, рН=7,2-7,4) і інкубували при 37?С протягом 2-4 годин. Потім бактерії інокулювали в 10 літрах вищевказаного середовища і інкубували при 37?С протягом 24 годин зі струшуванням. Бактерії одержували центрифугуванням (5000 g, 4?С, 10 хвилин) і тричі відмивали холодною дистильованою водою. Бактеріальні клітини руйнували копром з стерильними скляними кульками діаметром 0,1 міліметра (Biospec Products, USA). Копер використовували протягом 5 циклів по 90 секунд кожний. Після седиментації кульок супернатант збирали і кульки тричі промивали. Супернатанти після промивання центрифугували (14000 g, 4?С, 4 хвилини), а потім виділяли білий верхній прошарок гранул, який містив стінки бактеріальних клітин. Клітинні стінки ресуспендували в холодній дистильованій воді і промивали. Для виявлення інтактних клітин бактерій використовували фарбування за Грамом. Клітинні стінки ресуспендували в 2 % розчині натрію додецилсульфату і інкубували протягом 12 годин. Матеріал двічі відмивали дистильованою водою, а потім 0,05 М NaH2PO4 (рН=7,0) і 0,05 М трис-хлористоводневою кислотою (рН=7,5). Клітинні стінки ресуспендували в 200 мл розчину 0,05 М трис-хлористоводневої кислоти, що містив 5 ммоль магнію хлорид, 5 мг/л ДНКази (Sigma, США), 5 мг/л РНКази (Sigma, США) і повільно струшували при 37?С протягом 1 години. Наприкінці додавали 200 мг/л трипсину і суміш струшували ще 4 години. Після центрифугування гранули ресуспендували в 50 мл дистильованої води, змішували з 50 мл 80 % фенолу і центрифугували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після цього центрифугування фракцію клітинних стінок старанно збирали з поверхні, ресуспендували в дистильованій воді і тричі промивали в холодній дистильованій воді. Потім фракцію ресуспендували в 20 мл 10 % трихлороцтової кислоти для видалення ТК і центрифугували при 4?С 24 години. Чистий ПГН був отриманий центрифугуванням, після чого його ресус