РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Загальна характеристика обстежених осіб
Нейтрофіли та моноцити були виділені з периферійної крові 182 хворих, які знаходились на лікуванні у оториноларингологічному відділенні Луганської міської клінічної багатопрофільної лікарні № 1 з січня 2005 року по жовтень 2006 року, у тому числі: 34 (18,68 %) хворих на хронічний середній отит, 47 (25,82 %) хворих на хронічний тонзиліт, 101 (55,49 %) хворого на хронічний синусит. У 35 пацієнтів (19,23 %) діагностований хронічний катаральний синусит, у 32 осіб (17,58 %) - хронічний гнійний синусит, у 34 пацієнтів (18,68 %) - хронічний запально-проліферативний синусит. Вік хворих коливався від 20 до 35 років (середній вік - 27,30?1,37 років). Всі пацієнти були чоловічої статі.
Нейтрофіли та моноцити отримували з периферійної крові хворих у фазу загострення (при надходженні до стаціонару) та у фазі ремісії (у кінці курсу лікування).
Групу референтної норми склали 38 практично здорових чоловіків у віці від 20 до 35 років (середній вік - 26,94?1,35 років).
Робота виконувалась у відповідності до біоетичних норм з дотриманням відповідних принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції ради Європи про права людини і біомедицини та відповідних законів України. Всі обстежені дали письмову згоду на участь у дослідженні.
2.2. Методи досліджень та статистична обробка одержаних результатів
Кров забирали ранком, натще, з пальця на загальний аналіз і з вени ліктьового згину для імунологічних і біохімічних досліджень. Кров вносили до стерильних скляних пробірок, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували і для одержання плазми відстоювали протягом 2 годин у термостаті при 37?С.
Імунологічні та біохімічні дослідження проводили в науковій лабораторії кафедри патофізіології Луганського державного медичного університету (завідувач кафедри - професор Н.К. Казімірко).
Популяції моноцитів і нейтрофілів периферійної крові одержували за допомогою центрифугування на подвійному градієнті щільності 1,077 і 1,093 фіколу-верографіну за H.R. Recalde (1994) [51, 75]. Чистоту суспензії моноцитів (89-98 %) підтверджували імунофлуоресцентним методом із використанням моноклональних антитіл до рецепторів CD14. Життєздатність клітин у суспензії підтверджували в тесті з трипановою синькою (вона складала 89-93 %).
Визначення фагоцитарної активності моноцитів і нейтрофілів периферійної крові проводили чашковим методом. Клітини в концентрації 2*6 lg/мл вносили до 2,0-2,5 мл середовища 199 у мікрочашки Петрі з тонкого скла діаметром 4 см, добавляли 0,5 мл свіжовиготовленої робочої суспензії добової культури золотавого стафілокока, яка містила за оптичним стандартом 1,5 мільярда мікробних клітин у 1 мл, після чого закриті чашки Петрі інкубували в термостаті при 37°С протягом 1 години. Після витягу чашок Петрі з термостата їх обережно триразово промивали стерильним ізотонічним розчином натрію хлорид, при цьому лімфоцити видаляли з промивним розчином. Чашки Петрі підсушували в термостаті: клітини, які находились на їх дні, фіксували в розчині, який містив 9 частин метанолу і 1 частину 25 % альдегіду глутарової кислоти, фарбували свіжовиготовленим розчином барвника, який містив 1,5 частини 0,1 % водного розчину азуру, 1 частину водного розчину еозину і 2,5 частини свіжовиготовленої і охолодженої двічі дистильованої води. Моноцити і нейтрофіли складали 95-98 % клітинних елементів, як прилипали до дна чашок Петрі. Підраховували фагоцитарний індекс (ФІ - індекс Гамбургера) - відсоток клітин, які приймають активну участь у фагоцитозі, від загальної їх кількості, фагоцитарне число (ФЧ - індекс Райта) - кількість поглинених стафілококів на 1 клітину, яка приймає участь у фагоцитозі, та індекс перетравлення (ІП) - відсоток перетравлених мікробних клітин від загальної їх кількості, поглинутих 100 нейтрофілами або моноцитами.
Визначення МДА проводили за методом Стальної І.Д. та Гаришвілі Т.Г. (1977) [67]. У дослідні центрифужні пробірки наливали по 1 мл дистильованої води, 0,5 мл лізату суспензії нейтрофілів або моноцитів у концентрації 3*6 lg клітин/мл, 2,0 мл 20 % трихлороцтової кислоти і 0,2 мл 5 М хлористоводневої кислоти. Осад, що утворився, відокремлювали центрифугуванням протягом 10 хвилин при 3000 оборотах на 1 хвилину. 2 мл надосадової рідини переносили до чистих пробірок, додавали по 1,0 мл 0,8 % водного розчину тіобарбітурової кислоти і приміщали на 10 хвилин у киплячу водну лазню. Розвивалося рожеве фарбування. Пробірки охолоджували проточною водою і вимірювали оптичну щільність розчину при довжині хвилі 532 нм у кюветах товщиною 1 см проти контролю, яким служили 2,0 мл води, 2,0 мл 20 % трихлороцтової кислоти і 2,0 мл тіобарбітурової кислоти. Кількість МДА розраховували за формулою:
МДА=гальмування*розчинення/1,56*10*см*М, (2.1)
виходячи з молярного коефіцієнта гальмування (1,56*10*см*М). Отримані результати виражали в мкмоль на літр.
Визначення дієнової кон'югації (ДК) ненасичених вищих масних кислот здійснювали за методом Стальної І.Д. (1977) [66]. З'єднували 0,2 мл лізату суспензії нейтрофілів або моноцитів у концентрації 3*6 lg клітин/мл із 1,8 мл реактиву (суміш гептану з ізопропиловим спиртом у співвідношенні 1:1). Закривали пробірки корками, щоб виключити випарювання екстрагуючої фази. Залишали проби на 15 хвилин, після чого центрифугували при 6000 оборотів на 1 хвилину 10-15 хвилин. Надосадову рідину переносили в градуйовані пробірки, додавали дистильовану воду (1/10 частина супернатанту). Після енергійного струшування і наступного розподілу рідини видаляли верхню гептанову фазу. До 0,5 мл цього розчину (дослід) і паралельно до 0,5 мл гептану (контроль) доливали по 2,5 мл метилового спирту і вимірювали оптичну щільність дослідів на спектрофотометрі при довжині хвилі 233 нм проти контролю. Вміст ДК у дослідах розраховували за формулою:
ДК=гальмування*розчинення/