РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение эритроцитов.
В работе была использована консервированная донорская кровь (мужская) II
группы. Эритроциты получали путем 4-х кратного центрифугирования в растворе,
содержащем 0,09 Моль/л KCl, 0,045 Моль/л NaCl, 0,044 Моль/л сахарозы, 0,005
Моль/л глюкозы, 0,01 Моль/л трис-буфера [91] (рН=7,4) при 1500 g. Соотношение
эритроцитов и отмывочного раствора составляет 1:10. Внутриклеточное значение рН
полученных эритроцитов составляет 7,1-7,2.
Получение эритроцитов негемолизированной фракции.
Эритроциты помещали в раствор 3 Моль/л NaCl (время экспозиции 10 сек.) или в
раствор 1,5 Моль/л NaCl (время экспозиции 45мин) при комнатной температуре
(18-200С). После экспозиции в гипертоническом растворе клетки переносили в
изотонический раствор и осаждали эритроциты путем 3-х кратного
центрифугирования при 1500 g физиологическим раствором до полного удаления
гемолизата. Внутриклеточное значение рН эритроцитов негемолизированной фракции
7,0-7,2.
Проведение гипертонического криогемолиза.
20 мкл осадка эритроцитов помещали в 1 мл гипертонического раствора (0,86
Моль/л сахарозы, 0,86 Моль/л сахарозы+0,15 Моль/л NaCl, 0,86 Моль/л сахарозы
+0,12 Моль/л Na2SO4 , рН = 7,4). В растворы до внесения эритроцитов вносили
барбитал, фенобарбитал, лидокаин в концентрациях 0,125-12,5 мМоль/л. Эритроциты
инкубировали в течение 45 мин на водяной бане при 370С, затем переносили на 5
мин на ледяную баню. Негемолизировавшие эритроциты осаждали путем
центрифугирования при 1500 g. Количество гемоглобина в супернатанте определяли
спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-4А с проточной кюветой при длине
волны 543 нм. Выход гемоглобина из клеток рассчитывали в процентах по отношению
к гемолизу эритроцитов (который принимали за 100%), после переноса
предынкубириванных эритроцитов в дистиллированную воду
Комбинированная обработка эритроцитов йодацетамидом и ПХМБ.
Комбинированная обработка эритроцитов йодацетамидом и ПХМБ проводилась в среде,
содержащей 0,09 Моль/л KCl, 0,045 Моль/л NaCl, 0,044 Моль/л сахарозы, 0,01
Моль/л трис-буфера (рН=7,4) [91]. Были использованы эритроциты с 20%
гематокритом. В среду обработки с эритроцитами вносили 0,015 Моль/л в конечной
концентрации йодацетамид. Обработку проводили в течение 30 мин на водяной бане
при 370С. Далее добавляли ПХМБ в конечной концентрации 0,001Моль/л и продолжали
инкубацию еще 60 мин при тех же условиях. В конце обработки эритроциты отмывали
путем центрифугирования при 1500 g.
Проведение постгипертонического лизиса.
Эритроциты помещали в гипертонические растворы, содержащие 1,5 и 3 Моль/л NaCl
в соотношении 1:10. В среду инкубации до помещения эритроцитов вносили
барбитураты и лидокаин в концентрациях 0,125-12,5 мМоль/л. Время инкубации в
растворе 1,5 Моль/л NaCl составляло 45 минут, в растворе 3 Моль/л NaCl – 8-10
секунд. Затем 5 мкл суспензии переносили в изотонический раствор, содержащий
0,15 моль/л NaCl (рН=7,4). Время инкубации в изотоническом растворе составляло
3 минуты.
Количество гемоглобина в супернатанте определяли спектрофотометрически на
спектрофотометре СФ-4А с проточной кюветой при длине волны 543 нм.
Проведение гипертонического гемолиза.
Перед гипертоническим воздействием клетки разводили в соотношении 1:1 раствором
NaCl (0,15-1,1 Моль/л) либо раствором сахарозы (0,3-1,1 Моль/л). Предынкубацию
осуществляли в течение 10 мин при заданной температуре (00С или 370С).
Гипертоническое воздействие осуществляли переносом эритроцитов в среду 4,0
Моль/л NaCl (1 мл) в соотношении 1:10 при температуре предынкубации. Инкубацию
проводили в течение 10 мин. В гипертоническую среду до внесения эритроцитов
вносили фенобарбитал, барбитал и лидокаин в концентрациях 0,125-12,5 мМоль/л.
Далее целые клетки осаждали центрифугированием при 1500 g в течение 3 минут.
Количество гемоглобина в супернатанте определяли спектрофотометрически на
спектрофотометре СФ-4А с проточной кюветой при длине волны 543 нм. Выход
гемоглобина из клеток рассчитывали в процентах по отношению к гемолизу
эритроцитов (который принимали за 100%), после переноса предынкубириванных
эритроцитов в дистиллированную воду.
Оценка транспортной активности белка полосы 3.
При помещении эритроцитов в среду, где анион Cl- заменен на SO2-4 с помощью
белка полосы 3 происходит Cl-/SO2-4Н+ –обмен. При транспорте анионов происходит
изменение рН среду инкубации эритроцитов [157], что делает возможным
использование метода рН-метрии для оценки интенсивности транспортных
процессов.
Оценка транспортной активности белка полосы 3 было проведено с помощью системы,
включающей рН-метр, термостатируемую ячейку (объемом 2,5 мл.), самописец Эндим
(ГДР) для графической регистрации изменений значений рН среды инкубации
эритроцитов. Измерения проводились при 370С.
Измерение внутриклеточного значения рН эритроцитов проводилось в среде 0,15
Моль/л NaCl. В ячейку вносили 2 мл физиологического раствора, после этого
вносили осадок эритроцитов в количестве 50 мкл. Эритроциты разрушались путем
добавления 10 мкл 20% Тритон Х-100. После чего фиксировали значение рН
гемолизата.
Для измерения транспортной активности белка полосы 3 в ячейку вносили 2 мл
среды инкубации, доводили значение ее рН до величины внутриклеточного рН
эритроцитов. В ходе эксперимента в среду измерения вносили анализируемые
вещества в различных концентрациях и осадок эритроцитов в количестве 50 мкл.
Графически изменения рН среды инкубации фиксировали с помощью самописца Эндим,
соединенного с рН-метром. После каждого измерения ячейку несколько раз
промывали дистиллированной водой и высушивали.
Графически кривая из
- Київ+380960830922