ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Получение эритроцитов
Объектом исследования служили эритроциты, полученные из свежей или
свежеконсервированной донорской крови, предоставленной Харьковской областной
станцией переливания крови. Для консервации крови применялся консервант
Глюгицир. С целью унификации объекта, в работе использовали кровь II группы,
полученную от доноров-мужчин. Сроки хранения крови – не более 5 дней. После
удаления плазмы эритромассу трижды отмывали путем центрифугирования при 1500 g
в течение 3 мин в 10-кратном объеме физиологического раствора
(0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный буфер, pH 7,4). Супернатант и
лейкоцитарную пленку удаляли методом аспирации. Эритроциты в виде плотного
осадка хранили при 4 °С и использовали в течение 4 часов.
Гипертонический стресс эритроцитов
Гипертоническое воздействие осуществляли перенесением равных аликвот суспензии
контрольных клеток и клеток, подвергшихся предварительной дегидратации в
умеренно гипертонических растворах, в 1 мл высококонцентрированного раствора
NaCl (2,0, 3,0 или 4,0 Моль/л), гематокрит 0,4 %. Перенесение и экспозицию
эритроцитов в гипертонической среде в течение 5 мин осуществляли при заданной
температуре (0 или 37°С). Далее целые клетки осаждали центрифугированием при
1500 g в течение 3 минут. Количество гемоглобина в супернатанте определяли
спектрофотометрически.
Предварительную дегидратацию эритроцитов производили перенесением 50 мкл
суспензии эритроцитов в растворы с различными концентрациями NaCl (0,15 – 1,00
Моль/л) при заданной температуре
(0 или 37 °С), и инкубировали в течение 2 мин.
Определение уровня гипертонического гемолиза эритроцитов
Уровень лизиса клеток, подвергнувшихся воздействию высококонцентрированных
солевых сред, определяли по светорассеянию гемоглобина в супернатанте на
спектрофотометре СФ-4А с проточной кюветой при длине волны 543 нм. Выход
гемоглобина из клеток рассчитывали в процентах по отношению к 100 % - му
гемолизу эритроцитов в присутствии 0,1 % раствора тритона Х-100. Количество
повторений в серии эксперимента - не менее 6 в двух параллельных пробах. Для
всех образцов производили вычисление среднего арифметического значения и
значения среднеквадратичного отклонения значения гемолиза. Каждый из
представленных в работе графиков отражает результаты из серии опытов одного
эксперимента, выраженные в среднем арифметическом значении уровня гемолиза
эритроцитов с соответствующим разбросом значений этой величины.
Вычисление антигемолитической активности амфифильного соединения.
Для выражения эффективности амфифильного соединения использовали понятие
антигемолитической активности. Значение максимальной антигемолитической
активности (АГmax) амфифильного соединения в серии опытов одного эксперимента
представляет собой среднюю арифметическую величину из значений максимальной
антигемолитической активности данного соединения, рассчитанных по формуле:
, где Г - величина гемолиза эритроцитов в данных экспериментальных условиях в
отсутствие амфифильного вещества; Гамф - минимальная величина гемолиза
эритроцитов в присутствии амфифильного вещества.
Динамика гемолиза эритроцитов и ее зависимость от температуры
Для регистрации динамики гипертонического гемолиза эритроцитов в работе была
использована установка для измерения малоуглового светорассеяния (расходимость
светового пучка 3°) клеточных суспензий, созданная на базе монохроматора СФ-4А.
Описание метода анализа клеток, основанном на измерении рассеяния света,
представлено в работах [14, 16, 163].
Уровень гемолиза эритроцитов как функцию времени определяли путем регистрирации
изменения во времени оптической плотности суспензии эритроцитов (длина волны
720 нм). Концентрация суспензии эритроцитов в кювете составляла (1,7 - 3,5) х
106 кл./мл. В рассматриваемом концентрационном диапазоне оптическая плотность
клеточной суспензии прямо пропорциональна количеству интактных клеток.
Светорассеяние теней, образующихся в процессе лизиса эритроцитов, и поглощение
света гемоглобином при указанной длине волны пренебрежимо малы [28, 43].
Скорость гемолиза эритроцитов определяли как тангенс угла наклона касательной,
проведенной к кинетической кривой изменения оптической плотности суспензии
эритроцитов, помещенных в высококонцентрированные солевые среды [19].
Морфологические изменения эритроцитов в процессе гипертонического гемолиза
Для решения задачи регистрации и анализа морфологических изменений клеток в
процессе гемолиза была выбрана оптико-электронная система, описанная в [42].
Полученные по описанной методике эритроциты помещали в 4,0 Моль/л раствор NaCl
при комнатной температуре. После перемешивания суспензии пробу в виде капли
переносили на предметное стекло микроскопа, наблюдения проводили на световом
микроскопе БИОЛАМ в проходящем свете. Регистрация морфологических изменений
клеток начиналась через 12-15 секунд после внесения клеток в гипертоническую
среду. Для регистрации динамических изменений клеток видеопоток с передающей
телевизионной камеры на основе ПЗС подавался на вход платы видеозахвата
компьютера. Частота кадров записи потока составляла 25 кадров/сек (дискретность
40 мсек). Выбранные параметры увеличения телевизионного микроскопа позволяли
фиксировать межкадровое изменение объектов в пределах характерных изменений их
размеров. Оригинальное программное обеспечение позволяло формировать запись
изображения с задаваемыми параметрами (длительность видеофрагмента, частота
кадров в нем, яркость и контрастность изображения), просматривать видеозапись в
реальном и задаваемом масштабах времени.
Модификация эритроцитов трифторперазином
- Київ+380960830922