РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводилися у Харківському державному медичному університеті. Окремі експерименти виконано на базі Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та у лабораторії отримання гамет і ембріонів in vitro Харківського біотехнологічного центру УААН. Робота виконувалася протягом 1997-2003 рр.
Дослідження передбачали:
- виділення [50, 115] і кріоконсервування ембріонів миші з використанням методів повільного програмного [154] і швидкого заморожування [30, 35];
- морфологічну оцінку [7, 50] і функціональну оцінку (культивування) [50] доімплантаційних ембріонів миші;
- проведення цитологічного аналізу з використанням методів світлової [23, 180] і електронної мікроскопії [50, 118].
2.1. Матеріал дослідження і його оцінка
Як матеріал для досліджень використовували ембріони лабораторної миші (Mus musculus) доімплантаційних стадій розвитку. Як відзначалося раніше, миша є стандартним модельним об'єктом в кріобіології систем репродукції, і хоча пряма екстраполяція на людину чи інший вид ссавців даних, отриманих у дослідженнях на цьому виді, неправомірна, можливо розцінювати отримані результати як характерні для плацентарних ссавців. Експерименти на тваринах проводили відповідно до правил "Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються з експериментальною і іншою науковою метою" [99].
2.1.1. Отримання і морфологічна оцінка ембріонів. Ембріони було отримано від самок мишей лінії CBA і гібридних F1(CBA?C57Bl), яких утримували у стандартних умовах віварію. Самок у віці 6-8 тижнів, що знаходилися в стані еструсу, піддавали гормональній стимуляції множинної овуляції (суперовуляції) з метою отримання достатньої кількості доімплантаційних ембріонів [33]. Для цього самкам внутрішньочеревно вводили гонадотропін сироватки жеребних кобил (ГСЖК) і, через 46-48 год, хоріонічний гонадотропін людини (лХГ). Доза гормонів становила 5МО. Самок підсаджували індивідуально до самців тієї ж лінії для спарювання і ранком наступного дня перевіряли наявність копулятивної (вагінальної) пробки. День виявлення копулятивної пробки вважали першим днем вагітності.
Забій вагітних самок здійснювали дислокацією шийних хребців. Ембріони вимивали з відпрепарованих яйцепроводів і рогів матки теплим (37°C) середовищем М-2 [50]. Ембріони різних стадій розвитку (рис. 2.1) отримували через визначені інтервали часу після ін'єкції лХГ, час уведення якого вважали за "час нуль": 2 бластомери через 42-46 год, 4 бластомери - 56-60 год, 8 бластомерів - 70-74 год. Матеріал вміщували в пластикові чашки Петрі. Пошук ембріонів і маніпуляції з ними здійснювали за допомогою стереоскопічного мікроскопу МБС-9.
Визначення стадії розвитку і морфологічну оцінку якості ембріонів здійснювали за допомогою стереоскопічного мікроскопу МБС-9 при збільшенні в 28 разів (загальний вид) і в 98 разів (для дослідження окремих бластомерів). Критеріями оцінки якості і стану ембріонів служили часові? параметри розвитку і наявність чи відсутність видимих морфологічних дефектів відповідно з прийнятою класифікацією [7].
Клас 1 (відмінні - гарні). Всі ембріони знаходяться на відповідній віку стадії розвитку, ушкоджених бластомерів менш 5%, а частка здатних до розвитку ембріонів становить 85%. Відмінні ембріони класу 1 мають прозору зону округлої форми, майже цілком заповнені бластомерами. Бластомери рівного розміру, мають чіткі контури і рівномірно заповнені зернистою цитоплазмою.
Клас 2 (гарні, близькі до нормального). Ембріони цього класу в основному відповідають стадії розвитку вагітності. Кількість ушкоджених бластомерів може доходити до 50%, але до подальшого розвитку здатні 70% бластомерів. Мінімальними морфологічними відхиленнями, що змушують віднести ембріони до класу 2, є поява бластомерів нерівномірного розміру, їх асиметричне розташування, поява гранул у перивіттеліновому просторі.
Рис. 2.1. Ембріони миші доімплантаційних стадій розвитку:
а - двоклітинний;
б - чотириклітинний;
в - восьмиклітинний ранній;
г - восьмиклітинний компактизований.
Клас 3 (задовільні). Відсоток дефектних бластомерів у цьому класі перевищує 50%, а значна кількість ембріонів відстає чи навіть цілком затримано в розвитку. До серйозних морфологічних відхилень відносять появу зруйнованих клітин, стискання бластомерів, збільшення перивіттелінового простору і появу в ньому великої кількості гранул. Можливо порушення форми ембріона, його сплощення.
Клас 4 (незадовільні, чи погані). Відсоток дефектних бластомерів набагато більше 50%, а ембріони майже нездатні до розвитку. Явними морфологічними дефектами є дефекти прозорої зони, значна кількість зруйнованих бластомерів, їх стискання, значне збільшення перивіттелінового простору, порушення форми.
В експериментах використовували ембріони класів 1 і 2.
2.1.2. Культивування ембріонів миші в умовах in vitro. Усі маніпуляції з ембріонами і виготовлення середовищ для культивування здійснювали в умовах стерильності в спеціальному ламінарному боксі. Середовища культивування стерилізували фільтруванням через міліпоровий фільтр із діаметром пір 0,22 мкм.
Ембріони культивували в краплях (100 мкл) культурального середовища М-16 з додаванням бичачого сироваткового альбуміну 4 мг/мл у пластикових чашках Петрі (d=40 мм) під мінеральною олією. Культивування проводили у газопроточному термостаті (СО2-інкубаторі) при температурі 38?C і газової суміші з 5% CO2, 5% O2, 90% N2. Життєздатність ембріонів оцінювали кожні 12 год і визначали її як частку ембріонів, що досягли в умовах культивування in vitro стадії пізньої бластоцисти, бластоцисти, що вилуплюється, і тієї, що вилупилася.
2.2. Кріоконсервування ембріонів
Для кріоконсервування ембріонів було обрано два методи - метод повільного програмного заморожування і метод швидкого заморожування, заснований на прямому зануренні у рідкий азот - з використанням гліцерину як кріопротектора. Вибір глі