Ви є тут

Регенерація печінки щурів після часткової гепатектомії та трансплантації ембріональних і диференційованих клітин печінки, які зазнали впливу низьких температур

Автор: 
Моісєєва Наталія Миколаївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2003
Артикул:
0403U001905
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты были проведены на самцах крыс массой 140-160 г.
Частичную гепатэктомию проводили по методу Higginsa, Andersona [136]. Для этого животным под ингаляционным эфирным наркозом вскрывали брюшную полость и удаляли среднюю и левую латеральные лобулы, которые составляют 68% печёночной массы.
Введение исследуемых препаратов осуществляли одновременно с частичной гепатэктомией в пульпу селезенки в количестве 1?107 клеток (0,3мл) из расчета на одно животное. Контролем служили крысы, которым в селезенку вводили равный объем среды консервирования.
Получение клеток эмбриональной печени человека. Клетки эмбриональной печени выделяли из эмбрионов человека 7-12 недель гестации неферментативным методом [15], модифицированным для малых объёмов. Криоконсервирование проводили под защитой 5% диметилсульфоксида по 3-х - этапной программе замораживания: с начальной скоростью 1?С/мин до -40?С, 10?С/мин от -40?С до -80?С с последующим погружением контейнеров с суспензией в жидкий азот. [184]. Хранение клеток эмбриональной печени осуществляли в низкотемпературном банке при -196?С. Образцы отогревали на водяной бане при 37?С не позже чем за 30 мин до трансплантации.
Жизнеспособность клеток печени оценивали по окрашиванию трипановым синим [194]. Для этого клетки инкубировали с 0,6%-м раствором красителя (приготовленном на 0,9%-м растворе NaCl, рН 7,4) в течение 5 мин при комнатной температуре и затем подсчитывали долю поврежденных (окрашенных) клеток. В экспериментах использовали суспензию клеток, содержащую не менее 70% жизнеспособных клеток. Концентрацию клеток в суспензии определяли по стандартной методике с подсчетом в камере Горяева [51].
Для изучения роли жизнеспособности клеток в некоторых сериях экспериментов суспензию криоконсервированных клеток эмбриональной печени (ККЭП) подвергали 10-кратному быстрому замораживанию-быстрому отогреву (БЗ-БО), которое проводили путём погружения контейнеров с суспензией в жидкий азот на 10 минут с последующим отогревом на водяной бане при 37?С. Жизнеспособность полученной суспензии составляла менее 1%.
Получение дифференцированных гепатоцитов крысы. Изолированные клетки печени (Гц) выделяли неферментативным методом (Кравченко Л.П., 1997) [57]. Брюшную полость анастезированных раствором тиопентала натрия животных вскрывали, вводили инъекционную иглу в V. Porta и закрепляли лигатурой. Печень отмывали от крови аэрированным раствором сахарозы в течение 20 мин при температуре 37?С. Затем печень извлекали из брюшной полости, быстро охлаждали до 0?С в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ KCL; 1,6 мМ Na2HPO4; 0,4 мМKH2PO4; 0,8 мМ CaCl2; 1% бычьего сывороточного альбумина (рН 7,4) [58]. После вибрации и фильтрования через нейлоновый фильтр полученная суспензия содержала 30-40% жизнеспособных клеток.
Очистку исходной суспензии клеток печени проводили путём центрифугирования на лабораторной центрифуге (ОПН-3УХЛ 4.2 №7566) при 1000g в течение 1-4 минут (3 раза) в той же среде [58]. Данный метод позволял получить из печени массой 8-10 г. 200?106 - 250?106 интактных гепатоцитов с жизнеспособностью 90-95%.
Условия холодового хранения и консервирующие растворы для хранения гепатоцитов. Гипотермическое хранение изолированных гепатоцитов осуществляли в бакпечатках в изотонической среде с концентрацией клеток 3-5 млн/мл в бытовом холодильнике при температуре 4 ?С в течение 2-х суток. Отбор образцов проводили после однодневного и двухдневного гипотермического хранения. Средой гипотермического хранения изолированных гепатоцитов служил сахарозосодержащий раствор (ССР) - изотонический раствор сахарозы (0,25 М), сбалансированный солевыми компонентами, с добавлением бычьего сывороточного альбумина 1% [58].
Все подопытные животные были разделены на следующие группы:
- неоперированные крысы (интактные);
1 - крысы после 70%-ной гепатэктомии, которым в пульпу селезенки вводили среду криоконсервирования клеток (0,3 мл) (контрольная);
2 - крысы после 70%-ной гепатэктомии, которым в пульпу селезенки вводили 1х107 ККЭП (0,3 мл);
3.- не оперированные крысы, которым в пульпу селезенки вводили 1х107 ККЭП (0,3 мл);
4 - крысы после 70%-ной гепатэктомии, которым в пульпу селезенки вводили 1х107 нежизнеспособных (БЗ-БО) ККЭП (0,3 мл);
5 - крысы после 70%-ной гепатэктомии, которым в пульпу селезенки вводили 1х107 свежевыделенных гепатоцитов (0,3 мл);
6 - крысы после 70%-ной гепатэктомии, которым в пульпу селезенки вводили 1х107 изолированных гепатоцитов, после однодневного гипотермического хранения клеток при 4 ?С;
7 - крысы после 70%-ной гепатэктомии, которым в пульпу селезенки вводили 1х107 изолированных гепатоцитов после двухдневного гипотермического хранения клеток при 4 ?С.
Степень регенерации печени у экспериментальных крыс (R) определяли по формуле [101]:
R =(Wreg-Wres)Wect?100%,
где Wreg - масса регенерированной печени;
Wres - масса части печени, оставшейся после 70%-ной гепатэктомии;
Wect - масса эктомированной печени.
Продолжительность гексеналового сна оценивали с помощью метода Трахтенберга [66]. Гексенал экспериментальным крысам вводили внутрибрюшинно из расчета 40 мг на 1 кг массы животного.
Количество эритроцитов подсчитывали в камере Горяева по унифицированному методу [44] при помощи светового микроскопа.
Подсчет количества лейкоцитов проводили по унифицированному методу в камере Горяева [44].
Определение концентрации альбумина в сыворотке экспериментальных крыс. Концентрацию альбумина определяли с помощью диагностического набора "Агат". К 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз 0,9%-м раствором хлорида натрия, добавляли 4,0 мл раствора бромкрезилового зелёного (БКЗ). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 625 нм (625-630 нм, красный светофильтр) против холостой пробы (вместо сыворотки брали 0,1 мл дистиллированной воды) в кювете с толщиной слоя 1 или 0,5 см. Калибровочную пробу обрабатывали так