РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
Объектами исследования были выбраны компоненты фетоплацентарного комплекса, такие как плазма, суспензия эритроцитов кордовой крови и ткань плаценты. Кровь и плаценту заготавливали при физиологических родах у соматически здоровых женщин с не осложненным течением беременности. Кровь получали из сосудов последа (плаценты и пуповины) после рождения ребенка и отделения его от матери. Были использованы следующие криопротекторы: 1,2-ПД ("Химпром", Кемерово), фармакопейный препарат ДМСО и Гл фирмы "Reanal" (Венгрия). Перед использованием Гл и 1,2-ПД дополнительно очищали вакуумной дистилляцией, ДМСО - предварительной адсорбцией с окисью алюминия с последующей вакуумной дистилляцией.
Цельную кордовую кровь, приготовленную на консерванте "Глюгицир", центрифугировали 5 мин. при 800g. Собирали плазму и смешивали ее с растворами криопротекторов в соотношении 1:1. Эритроцитарный осадок дважды отмывали 155 мМ Na - фосфатным солевым буфером рН 7.4 (150 мМ NaCl + 5 мМ Na - фосфатного буфера) и центрифугировали. Полученный после снятия надосадка плотный осадок эритроцитов (эритромассу) смешивали с растворами 1,2 - ПД, Гл и ДМСО, различных концентраций. Растворы криопротекторов готовили на том же Na - фосфатном солевом буфере, которым производилась отмывка клеток. Приготовление растворов проводилось весовым способом. Точность взвешивания на аналитических весах составляла ± 0,1 мг. Погрешность концентрации не превышала ± 0,1 %. Добавление растворов криопротекторов производили при температуре 0?С, покапельно, при постоянном перемешивании. При анализе влияния на эритроциты температуры смешивания с криопротектором в микроскопических исследованиях и измерениях гемолиза использовали температуры добавления 0, 20 и 37 ?С. Экспозиция эритроцитов с растворами неэлектролитов составляла 15 мин.
Плаценту отмывали в 0.9% растворе хлорида натрия от слизи и крови, отделяли пуповинный канатик и амниотическую оболочку. Затем плаценту переносили в лоток, где срезали скальпелем фрагменты ткани с материнской стороны в области долек размером 2 ?2 см и массой 1 г. Приготовленные образцы плаценты помещали в среды эквилибрации, представляющие собой растворы 1.2-ПД, Гл и ДМСО, приготовленные на Na - фосфатном солевом буфере. Были выбраны следующие концентрации криопротекторов: 10%, 40%, и 60%. Время эквилибрации образцов плаценты в растворах 1.2-ПД и Гл составляло 20, 60 мин и 24 часа, а в растворах ДМСО 20 мин, 1 ч, 10 ч, 18 ч, 21 ч, 24 ч и 7 суток. Температура эквилибрации в растворах криопротекторов составляла +4°C.
Замораживание всех образцов осуществлялось путем погружения в жидкий азот. При этом средняя скорость охлаждения составляла 200°С в минуту. Оттаивание проводилось на водяной бане при температуре +40°С ? +42°С до появления жидкой фазы.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Метод дифференциальной сканирующей калориметрии
Исследования низкотемпературных фазовых переходов и стеклования в области температур 0?-196?С проводили на дифференциальном сканирующем калориметре, разработанном в институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины [52]. Особенностью этого прибора является то, что его рабочую камеру можно предварительно охладить до любой заданной температуры в диапазоне 273 - 77? К, а затем поместить в ячейку образец, который был заранее охлажден с любой требуемой скоростью. Это позволяет исследовать образцы, охлажденные с высокими скоростями вне калориметра. Термограммы регистрировали при нагреве со скоростью 0,5°С в минуту. Погрешность измерения температуры составляла ? 0,2 ?С, погрешность измерения теплопоглощения ? 2,5 %.
Для калориметрических исследований эритроциты после смешения с растворами криопротекторов осаждали центрифугированием при 800 g в течение 5 мин и отделяли плотную суспензию клеток от надосадочной жидкости. Таким образом, получили три вида образцов: 1 - эритромасса, смешанная с равным объемом криозащитного раствора, 2 - плотный осадок эритромассы, полученный после центрифугирования первого образца, 3 - надосадочная жидкость.
2.2.2 Метод ядерного магнитного резонанса
Концентрацию криопротекторов в образцах определяли методом 'Н ЯМР высокого разрешения. Исследования проводили на спектрометре ядерного магнитного резонанса для протонов "TESLA ВS 567А" (Чехословакия) с рабочей частотой 100 МГц, используя методику, описанную в [58]. Метод основан на том, что интегральная интенсивность сигнала поглощения пропорциональна числу резонирующих ядер. Это позволяет использовать интенсивность сигнала водородосодержащей группы как меру концентрации вещества в образце. Исследуемые образцы (0,4 мл) помещали в стандартную стеклянную ампулу 0,5 мм. В качестве эталона при записи спектров ЯМР использовали тетраметилсилан (ТМС) в запаянной стеклянной ампуле, которую помещали в ампулу с исследуемым образцом. Температуру при исследованиях поддерживали с точностью + 0.5?С.
2.2.3 Методы оптической и растровой электронной микроскопии
Для исследований методами микроскопии плотную эритромассу ресуспендировали Na - фосфатным солевым буфером в соотношении 1:4. Ресуспендированную клеточную суспензию смешивали с 20%, 40%, 60% и 80% растворами 1.2-ПД, Гл и ДМСО в соотношении 1:1.
Криомикроскопические исследования проводили с помощью специальной криоприставки к световому микроскопу. Добавление раствора криопротектора к суспензии эритроцитов КК производили непосредственно на предметном столике микроскопа. Температуру образца в криоприставке измеряли с помощью медь-константановой термопары. Скорость замораживания-нагрева задавалась программным блоком. В исследованиях был использован интерференционно-поляризационный микроскоп PSO-5 (Польша) в режиме интерференционного контраста в составе микрокиноустановки
МКУ-3. Охлаждение и нагрев проводили со скоростями 7-9 °С/мин. Образцы охлаждали до умеренно низких температур [106].
Для исследований методами световой и растровой электро