Раздел 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
С целью решения поставленных задач в работе были использованы иммунологические,
гематологические, морфологические, цитологические и биохимические методы
исследования.
Эксперименты проведены на половозрелых мышах-самцах линии СВА массой 18-20 г.,
содержащихся в стандартных условиях вивария ИПКиК НАНУ.
Животные были разделены на 5 групп. Контролем служила 1-я группа интактных
животных. У мышей 2-й, 3-й, 4-й и 5-й групп индуцировали АА. Мышам 3-й и 4-й
группы внутривенно вводили соответственно НСП и КСП В качестве контроля
специфического действия препаратов животным 5-й группы вводили клетки печени
взрослых животных (КВП) [6]
Все манипуляции с мышами проводили, соблюдая положения Европейской конвенции по
охране позвоночных животных и национального законодательства по гуманному
обращению с животными [129, 130].
2.1. Метод индукции адъювантного артрита
Адъювантный артрит индуцировали по методу Пирсона субплантарным введением
полного адъюванта Фрейнда, содержащего 3 мг/мл Micobacterium tuberculosis
[190]. Выбранная модель является адекватной моделью клинической формы РА, т.к.
в данной дозе адъювант инициирует состояние, имеющее все морфофункциональные
признаки данной патологии [45].
2.2. Методы приготовления и введения суспензии плаценты и клеток взрослой
печени.
Приготовление СП
Приготовление СП осуществляли согласно методическим рекомендациям [31]. Для
этого выделенную в стерильных условиях плаценту помещали в чашку Петри с
физиологическим раствором, трижды отмывали от слизи и крови, после чего
измельчали в гомогенизаторе Поттера в соотношении 1:2 (плацента:физиологический
раствор) до получения однородной массы. Полученную суспензию пропускали через
капроновый фильтр и иглы уменьшающегося диаметра. Количество клеток в суспензии
подсчитывали в камере Горяева.
Приготовление суспензии клеток печени взрослых животных
Суспензию КВП получали путем механической дезинтеграции ткани органа в
гомогенизаторе Поттера с использованием раствора Хенкса с добавлением 3%
цитрата натрия и ЭТС [6]. Полученную суспензию пропускали через капроновый
фильтр и трижды центрифугировали при 1000g в течение 5 мин.
Введение суспензии плаценты и клеток печени взрослых животных
Нативную и криоконсервированную суспензию плаценты 19-х суток гестации вводили
в день инициации патологии внутривенно в объеме 0,2 мл, который содержал 1х106
кл/мл КВП вводили в аналогичном объеме.
2.3. Методы криоконсервирования суспензии плаценты
Для криоконсервирования СП использовали раствор «Пропандиосахароль». В его
состав входят: пропиленгликоль (370,0 г.), безводная сахароза (32,0 г.), хлорид
натрия (6,0 г.), бидистиллированная вода до 1000 мл. Согласно данным литературы
[31], скорость 10С/мин является оптимальной для замораживания СП. Исходя из
этого, в 1-ой серии экспериментов после 20-и минутной эквилибрации СП с
криопротектором при комнатной температуре образец замораживали со скоростью
10С/мин до –400С с последующим погружением в жидкий азот (режим К1). Во 2-й
серии экспериментов был применен аналогичный режим замораживания с некоторыми
модификациями процесса подготовки образца к криоконсервированию:
1. Вместо перемешивания клетки СП “наслаивали” на криопротектор.
2. Приготовленный ШсэндвичШ клетки-криопротектор без предварительной
эквилибрации при комнатной температуре погружали в программный замораживатель
«Cryoson» (Германия) и охлаждали до 00С. При этом скорость охлаждения СП
подбиралась таким образом, чтобы время прохождения этого температурного
интервала совпадало с рекомендуемым временем эквилибрации клеток СП с
криопротектором (режим К2).
Отогрев образца проводили в водяной бане при температуре 420С в течение 45-50
сек. при постоянном перемешивании до полного исчезновения кристаллов льда.
Сохранность клеток СП после гомогенизации и криоконсервирования оценивали
общепринятым "экспресс-методом" с помощью 0,2% водного раствора трипанового
синего [85].
2.4. Исследование апоптотической активности иммунокомпе-тентных клеток
С целью изучения апоптоза были использованы морфологические и биохимические
методы исследования.
2.4.1. Определение морфологических изменений в апоптотических клетках.
Для количественной оценки содержания апоптотических клеток в тимусе,
лимфоузлах, региональных к месту введения полного адъюванта Фрейнда, в клетках
перитонеальной полости и периферической крови использовали индекс апоптоза
(ИАп), который рассчитывали по формуле:
ИАп= (Количество апоптотических клеток / Общее количество клеток) х 100% [93].
Апоптоз клеток в перитонеальной полости и периферической крови оценивали
методом световой микроскопии (световой микроскоп BIOLAR (Poland) под окуляром *
10 и объективом *20, *40), позволяющей выявить морфологические изменения,
характеризующие данный процесс. Для этого приготовленные мазки окрашивали по
Романовскому-Гимзе с последующим подсчетом процента клеток с конденсацией и
фрагментацией хроматина [50].
Для визуализации ядер апоптотических клеток в тимусе и лимфатических узлах
применяли метод люминесцентного анализа. Для этого тестируемые клетки
инкубировали с ДНК-тропным красителем – Hoechst 33342 (Sigma, Israel) в
конечном разведении 0,1 мкг/мл в соотношении 1:1 на протяжении 30 минут при
370С [203]. Концентрация клеток составляла 1х106 /мл. После инкубации клетки
отмывали средой RPMI-1640 с добавлением 1% эмбриональной телячьей сыворотки и
3% цитрата натрия путем центрифугирования при 1500g в течение 5 минут. Анализ
апоптотических изменений осуществляли на люминесцентном микроскопе ЛюмамР1
(Ломо) (объектив – х40, окуляр – х10).
2.4.2. Оп
- Київ+380960830922