ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал исследования: кордовая и донорская кровь человека.
Объект исследования: эритроциты кордовой и донорской крови человека.
Использовалась донорская кровь мужчин группы А (II) в возрасте до 40 лет и
кордовая кровь человека, полученная после нормальных родов. Материал
заготавливали на консерванте «Глюгицир».
2.1 Получение эритроцитов.
Для удаления плазмы и лейкоцитов эритроциты осаждали центрифугированием при
3000 об/мин (центрифуга ОПН-3). Затем клетки трижды отмывали 3-4-х кратными
объемами физраствора (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCІ, рН 7,4) с применением
аналогичного режима центрифугирования.
2.2 Обработка эритроцитов криопротектором ПЭО-1500 и замораживание-отогрев.
Для исследования модификаций белок-белковых взаимодействий и изменения липидной
асимметрии, вызванных эффектами криопротектора и температуры, отмытые от плазмы
эритроциты как кордовой, так и донорской крови были разделены на три
экспериментальные группы:
1). Эритроциты, инкубированные в физиологическом растворе, содержащем 150 мМ
NaCl, 10 мМ Трис-НCl (рН 7,4) при 370С в течение 40 минут;
2. Эритроциты, инкубированные с ПЭО-1500 в конечной концентрации 15%, в
растворе, содержащем 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НCl (рН 7,4) при температуре 0-40С
в течение 40 минут [6].
3. Эритроциты, инкубированные с ПЭО-1500 в конечной концентрации 15%,
приготовленным на основе физиологического раствора (150 мМ NaCl, 10 мМ
Трис-НCl, рН 7,4) при температуре 370С в течение 40 минут;
После приготовления раствор ПЭО-1500 выдерживали при комнатной температуре 24
часа. Перед смешиванием суспензия клеток и растворы криопротектора были
доведены до соответствующих температур. Раствор ПЭО-1500 вводили в клеточную
суспензию путем добавления равного объема криоконсерванта порциями через каждые
4 мин по каплям с постоянным перемешиванием в течение 40 мин (дозированное
добавление).
Клетки замораживали в стандартных алюминиевых контейнерах объемом 10 мл.
Замораживание осуществляли до температуры -1960С путем быстрого погружения
контейнера в жидкий азот. Оттаивание производили на водяной бане при
температуре 40-420С с постоянным покачиванием контейнера.
2.3 Моделирование трансфузии.
После размораживания клетки, обработанные криопротектором ПЭО-1500, были
разделены на 2 части. Часть клеток осаждали центрифугированием при 1000 об/мин
в течение 10-15 мин., удаляли супернатант, а эритроциты использовали для
получения теней. Другая часть клеток была использована для оценки обратимости
изменений в мембрано-цитоскелетном комплексе криоконсервированных эритроцитов
при моделировании трансфузии. Для этого эритроциты переносили в физиологический
раствор (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НCl (рН 7,4)) (1:10 по объему) с поддержанием
температуры 370С в течение одного часа. После завершения инкубационного периода
эритроциты осаждали при 1500 об/мин и также использовали для получения теней.
2.4 Получение белых теней эритроцитов.
Аликвоты эритроцитов инкубировали в 20 объемах сред с разной ионной силой и
содержанием двухвалентных катионов.
Общепринятым методом получения теней эритроцитов является гипотонический шок по
методу [107], с использованием 5 мМ натрий-фосфатного буфера. Получение теней
эритроцитов в изотонических и используемых нами растворах высокой ионной силы
невозможно без внесения в лизирующую среду дополнительных реагентов. Одним из
таких веществ является сапонин. Поэтому, прежде чем анализировать модификации
белкового спектра мембрано-цитоскелетного комплекса эритроцитов под влиянием
ПЭО-1500 и температуры в условиях варьирования ионной силы и содержания
двухвалентных катионов, необходимо было учесть специфику используемых способов
получения теней и в первую очередь применения неионного детергента - сапонина.
Таким образом, изучение влияния сапонина на мембрано-цитоскелетный комплекс
эритроцитов оценивали при гипотоническом способе получения теней (5 мМ КСl, 10
мМ Трис-НСl (рН 7,6)) в Са2+-содержащих средах (10-5M CaСl2, 10 -3M MgCl2) и в
бескальциевых растворах с использованием хеллатора двухвалентных катионов ЭДТА
(2 мМ). На этапе лизиса все растворы содержали ингибитор протеаз -
фенилметилсульфонилфлуорид (PMSF) (1 мг/мл).
С целью обнаружения изменений в межбелковых взаимодействиях цитоскелетных
компонентов, происходящих в процессе криоконсервирования клеток в присутствии
ПЭО-1500, эритроциты экспонировали в растворах с разной ионной силой (среды А,
Б, В), используя два способа получения теней: в изотоническом растворе и в
растворах с высокой ионной силой.
Состав среды А - 135мМ KCl, 10 мМ Трис- HCl (рН 7,6), 0,02% сапонин, с
включением добавок:
(1) 10-6M CaСl2, 10-3M MgCl2;
(2) 10-5M CaСl2, 10-3M MgCl2;
(3)10-3M CaСl2, 10-3M MgCl2;
(4) 2 мМ ЭДТА.
Состав среды Б - 250 мМ КСl, 10 мМ Трис-НСl (рН 7,6), 0,02% сапонин, с
добавлением вышеуказанных компонентов (1-4);
Состав среды В - 500 мМ КСl, 10 мМ Трис-НСl (рН 7,6), 0,02% сапонин, с
аналогичными добавками (1-4).
Схема експеримента на эритроцитах кордовой крови соответствовала схеме для
эритроцитов донорской за исключением растворов с тоничностью 5мМ KCl и 250мМ
KCl, и концентрации двухвалентных катионов 10-5М Са2+, 1мМ Mg2+.
На этапе лизиса все растворы содержали сапонин (0,02%), PMSF (1мг/мл),
дитиотриэтол (ДТТ) (10 мМ).
Для приготовления всех растворов использовали деионизированную воду.
Ранее, в экспериментах с применением диамида - вещества, сшивающего белковые
молекулы по SH-группам было показано [108, 121], что в процессе
криоконсервирования эритроцитов происходят перестройки цитоскелетных белков и
образование высокомолекулярных агрегатов «с
- Київ+380960830922