ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение экстракта из кожи новорожденных поросят.
Новорожденных (односуточных) поросят доставляли в институт из агрокомбината
“Слобожанский” Харьковской области. Животных декапитировали под поверхностным
эфирным наркозом. Кожу иссекали на фрагменты массой 5-10 мг, трехкратно
отмывали в 10-ти кратном объеме физиологического раствора при +4°С.
Все эксперименты проводили согласно правил „Европейской конвенции защиты
позвоночных животных, используются в экспериментальных и других научных целях”
(Страсбург, 1985 г).
В качестве криопротектора использовали ПЭО-400 и ПЭО-1500 в конечных
концентрациях 10%-в. Целесообразность использования ПЭО с различными
молекулярными массами обусловлена их свойствами. Прежде всего тем, что эти
соединения оказывают заметное структурирующее действие на воду и являются
малотоксичными соединениями, которые не требуют дополнительной отмывки [10,
21]. Замораживание выполняли со скоростью 1°С/мин на программном замораживателе
УОП-6, производства СКТБ с ОП ИПКиК АН Украины и со скоростью 8000°С/мин с
помощью устройства для сверхбыстрого замораживания биологических объектов.
Образцы помещали в контейнер из алюминиевой фольги, толщиной 0,030 мм. Размер
контейнера 35х45мм, в котором находилось около 0,5 мл взвеси фрагментов кожи,
толщина замораживаемого слоя составляла 0,3 мм. Материал отогревали на водяной
бане, при +38 - 40°С. Криопротектор ПЭО-1500 отмывали в 10-ти кратном объеме
физиологического раствора, для отмывания ПЭО-400 использовали 0,250 ммоль
раствора сахарозы. Экстракт получали, инкубируя измельченные фрагменты кожи в
физиологическом растворе (рН-7,4) в соотношении 1:10 при 20-23°С на протяжении
60 мин, центрифугировали в течение 15 мин-1500 об/мин и отбирали экстракт.
Белки из экстракта осаждали кипячением в течение 15 мин, затем
центрифугированием в течение того же времени при 3000об/мин [23]. Хранение
экстракта проводили в морозильной камере бытового холодильника при температуре
– 6°С.
Общую концентрацию белков в экстракте определяли с помощью модифицированного
метода Лоури [29, 85]. Чувствительность метода составляет 0,2 мкг белка.
Концентрацию пептидов и нуклеотидов определяли спектрофотометрическим методом
при длинах волн 280 нм и 260 нм соответственно по калибровочным кривым [85,
103].
2.2. Определение состава экстракта из криоконсервированных фрагментов кожи
новорожденных поросят.
При изучении молекулярно-массового распределения фракций веществ пептидной
природы использовали метод высокоэффективной гельпроникающей хроматографии –
ВЭГПХ [10, 87].
Для определения молекулярных масс пептидных фракций использовали предварительно
калиброванную стандартными веществами колонку. В качестве стандартных веществ
выбраны: инсулин, глюкогон, сoматостатин, В12, В2. Анализ осуществлялся на
приборе LKB (Швеция), который состоит из колонки с размерами 1,6х40 см,
перистальтического насоса LKB-2132, геля -TSK GEL TOYOPEARL HW-40, интегратора
WATEARS-746, ультрафиолетового оптического монитора - LKB-2238 NICORD S II и
самопищущего потенциометра LKB-2210 RECORDER. Подвижная фаза: фосфатно-солевой
буфер - рН 7,5, состоящий из Na2H2PO4- 30 ммоль/л, NaCL 100ммоль/л скорость
подвижной фазы-1,7 мл/мин. Молекулярные массы пептидных фракций изучаемого
препарата устанавливали по временам удерживания вышеуказанных реперных
веществ.
Для установления природы фракций экстракта, отличающихся молекулярной массой,
были получены УФ - спектры в области поглощения 254 нм.
2.3.Характеристика экспериментальных животных, моделирование
ожоговых и холодовых ран.
Эксперименты проведены на 180 белых крысах линии Вистар массой 150-200 гр.
Выбор крыс в качестве экспериментального объекта обусловлен следующими
соображениями. Крыса является лабораторным животным, наиболее часто
используемым при изучении патологических процессов, вызываемых
экспериментальными воздействиями на организм, в том числе теми из них, которые
связаны с различными повреждениями тканей. Это важно для сопоставления наших
данных с результатами других исследователей [142, 143]. В организме крысы
обнаруживают явления, которые сходные с происходящими при аналогичных
воздействиях и в организме человека [143].
Моделирование экспериментальных ожогов и отморожений проводили на 180 белых
крысах линии Вистар 150-200 гр.
Животные были разделены на 6 групп: для моделирования ожогов отбирали 3 группы
по 30 животных. 1-я группа, контрольная, где происходило заживление ран с
введением 0,9%-го физиологического раствора, 2-я группа – животные, которым
вводили экстракт плаценты официнальный ЭПл, 3-я группа - животные, которым
вводили экстракт кожи новорожденных поросят (ЭКНП). Для моделирования
отморожений, также отбирали 3 группы с аналогичным количеством животных и
распределением по группам. В качестве контроля сравнения был взят экстракт
плаценты официнальный: серия Р.12.99/01311, Государственного Киевского
предприятия по производству бактерийных препаратов “Биофарма”. Экстракт
плаценты является препаратом биологического происхождения, который включает в
себя фракции пептидов и применяется как терапевтический препарат в лечении
различных патологических состояний, а также лечения ран различной этиологии.
ЭПл также обладает некоторым стимулирующим действием на процессы репарации.
При выборе экспериментальных моделей температурного поражения должны
воспроизводиться травмы, которые встречаются у человека. Кроме того необходима
определенная стандартизация [63, 75, 76, 125]. Выбор термического агента
является важнейшим услов