Раздел 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Общие методические положения
Работа была проведена на базах Института проблем криобиологии и криомедицины
Национальной Академии наук Украины, Центра репродукции и генетики «Имплант» и
Института генетики и клеточной биологии Университета Лимбург (Маастрихт,
Нидерланды). Работа выполнялась на протяжении 2000 - 2005 гг.
2.2.Объекты исследования
В качестве объектов исследования использовали спермии, яйцеклетки и эмбрионы
человека.
Спермии получали из эякулятов мужчин супружеских пар, проходивших курс лечения
бесплодия методом ЭКО с ПЭ.
Яйцеклетки аспирировали пункцией яичников у женщин, участвующих в программе ЭКО
с ПЭ.
Эмбрионы были получены после инсеминации зрелых ооцитов in vitro
активноподвижными спермиями, выделенными из эякулята в градиенте плотности
Percoll [269].
2.3. Этические аспекты исследования
Все исследования выполнены с соблюдением правил биомедицинской этики [270].
Эмбрионы были использованы по остаточному принципу, после селекции и переноса
не более четырех эмбрионов в полость матки пациентки [271]. На проведение
исследований было получено письменное, свободное и информированное согласие
пациентов.
2.4.Общая схема исследований
индукция суперовуляции
Я
аспирация фолликулярной жидкости
Я
выделение ооцитов
Я
оценка ооцитов по морфологическим критериям
Я
культивирование ооцитов до стадии метафаза II мейоза
Я
оплодотворение in vitro Ю цитогенетический анализ
неоплодотворенных ооцитов
Я
культивирование зигот Ю морфологический анализ пронуклеусов
ЮкриоконсервированиеЮ культивирование
Я
культивирование 24 ч Ю эмбриоперенос
Я
криоконсервирование эмбрионов
Я
морфологическая оценка Ю FISH анализ, цитологический анализ, анализ состояния
хроматина
Я
культивирование in vitro до стадии бластоцисты
Я
фиксирование эмбрионов
Я
цитогенетический анализ, подсчет общего количества клеток
2.5. Методика экстракорпорального оплодотворения и культивирования эмбрионов in
vitro
2.5.1. Выделение ооцитов из аспирата. Ооциты аспирировали путем
трансвагинальной пункции фолликулов через 34-35 ч после инъекции 5000-10000 ед.
человеческого хорионического гонадотропина (Profasi “Serono”).
Аспират помещали в предварительно нагретые чашки Петри до 37°С и осуществляли
поиск ооцит-корона-кумулюсного комплекса. После его обнаружения, производили
предварительную оценку степени зрелости ооцитов по наличию либо отсутствию
первого полярного тела и плотности и растяжимости кумулюсного комплекса.
2.5.2.Оценка степени зрелости ооцитов. Визуальную оценку степени зрелости
ооцитов проводили под бинокулярной лупой Olympus SZ 11. Ооциты классифицировали
по [272], учитывая состояние ооцит - корона - кумулюсного комплекса.
К I степени относили глубоко незрелые ооциты - клеточное окружение необъемное,
клетки кумулюса плотно прилегают друг к другу;
II степень - незрелые ооциты, у которых клетки corona radiata окружают ооцит
плотным слоем, клетки кумулюса плохо растяжимые;
III степень - ооциты, с дисперсным, хорошо растяжимым кумулюсом, клетки corona
radiata плотно прилегают к ооциту;
IV степень - кумулюс расширен, corona radiata окружает яйцеклетку дисперсным
венцом. Для ооцита характерна круглая, ровная, гомогенная ооплазма;
V степень - яйцеклетка просматривается в виде тусклой сферы с глыбчатым
кумулюсом (рис.2.1).
Рис. 2.1. Ооциты разных степеней зрелости:
а - незрелый ооцит – II-я степень зрелости,
б – зрелый ооцит с плотным кумулюсом – III-я степень зрелости,
в – зрелый ооцит – IV-я степень зрелости,
г – перезревший ооцит – V степень зрелости),
нативный препарат, ув. x 400.
2.5.3. Цитологическое исследование эякулятов. Эякуляты получали у мужчин после
3-5-ти-дневной сексуальной абстиненции путем мастурбации. Приемником спермы
служила стерильная чашка Петри. Эякулят помещали в термостат (при температуре
37°С) до полного разжижения. Объем эякулята измеряли в мерной пробирке; pH
определяли сразу же после получения эякулята. Время разжижения оценивали с
момента эякуляции до полного разжижения.
После разжижения производили микроскопическую оценку эякулята при увеличении x
240; x480; x1200. Для определения концентрации сперматозоидов использовали
камеру Macler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel, 1980) - специальную
камеру для подсчета сперматозоидов, не требующую разведения спермы. При этом
0,01 мл неразбавленного образца семени помещали на счетную область камеры и
закрывали покровным стеклом, имеющим на своей поверхности специальную сетку из
ста квадратов. Число сперматозоидов, содержащихся в любых 10 малых квадратах,
представляло концентрацию сперматозоидов в млн/мл. Определяли процентное
содержание спермиев с быстрой прогрессивной подвижностью (активноподвижные) и с
медленной прогрессивной подвижностью (подвижные). Кинезисграмму составляли на
основании градации спермиев по скорости движения в камере следующим образом:
группа "а" (с быстрым прогрессивным прямолинейным движением; активноподвижные)
– спермии, которым для преодоления расстояния по диагонали одного квадрата
требуется менее 4-х сек;
группа "в" (с медленным прогрессивным движением; подвижные)- спермии,
преодолевающие путь по диагонали квадрата за 4-10 сек;
группа "с" (без прогрессивного движения) – спермии, затрачивающие на указанный
путь 10-30 сек.
Неподвижные спермии по указанной классификации составляют группу "d".
Нормоспермии соответствовали следующие показатели спермограммы: объем: 2-6 мл;
pH: 7,2 - 8,0; разжижение: 20-40 мин; концентрация: более 20 млн/мл; содержание
спермиев группы “а”: более 25 %; группы “в”: более 30 %; жизнеспособных: более
75 %; спермиев с