РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования служили верхушечные и боковые меристемы картофеля Solanum tuberosum сорта Косынь (холодостойкий, длиннодневный, тетраплоид) и винограда Vitis vinifera сорта Изабелла, вычленяемые из in vitro растений, выращиваемых в лабораторных условиях.
2.1. Экспланты, их получение и введение в in vitro культуру
2.1.1. Введение в культуру растений картофеля
Культуру картофеля in vitro получали путём отделения от картофельных клубней этиолированных (бесхлорофилльных) проростков и искусственного выращивания из них одностебельных растений.
Учитывая большую вероятность заражённости исходного посевного материала картофеля вирусами, клубни подвергали предварительной тепловой обработке. Их выдерживали в термостате при температуре 37 - 38°С в течение 40 суток [9]. Затем клубни проращивали в темноте при температуре 18 - 23?C и влажности 65 - 75 %. Спустя 2 - 4 недели, когда этиолированные проростки достигали длины 1 - 2 см, их срезали и промывали дистиллированной водой. Все последующие операции по стерилизации материала и введению его в культуру проводили в ламинарном боксе.
Проростки, срезанные с клубней, помещали в 70 % этиловый спирт, после чего трижды промывали бидистиллированной водой, затем их выдерживали в 30 % водном растворе "Белизны" или "Domestos" в течение 15 мин, и промывали 3 - 4 раза бидистиллированой водой на протяжении 10 - 15 мин [39].
Верхушки простерилизованных побегов картофеля длиной 0,5 - 0,8 см отсекали хирургическим ланцетом и высаживали в пробирки с жидкой питательной средой на подложки из фильтровальной бумаги или на поверхность агаризованой среды. Питательной средой для выращивания растений из меристем и микрочеренков являются многокомпонентные смеси, включающие минеральные соли, витамины, регуляторы роста, сахара.
Меристемы картофеля культивировали на "половинной" питательной среде по минеральным элементам Murashige&Skoog (MS) [146], отличающейся от оригинального состава уменьшенным количеством солей, содержащих азот: NH4NO3 - 412,5 мг/л и KNO3 - 950 мг/л.
Витамины: тиамин (В1) - 1,6 мг/л; пиридоксин (В6) - 1 мг/л; рибофлавин (В2) - 0,5 мг/л; никотиновая кислота (РР) - 1 мг/л.
Регуляторы роста: кинетин - 1 мг/л; индолилуксусная кислота (ИУК) - 0,5 мг/л.
Кроме того, в состав среды для культивирования добавляли: мезо-инозит (100 мг/л), сахароза (30 г/л) и, в случае использования агаризованной среды, бакто-агар (4 г/л).
Среды готовили на бидистиллированной воде. В состав среды вносили все компоненты, кроме фитогормонов, доводили рН до значения 5,65 - 5,75 и стерилизовали в автоклаве. Условия автоклавирования: Т = 111,8°С, давление 0,5 атм., время стерилизации 40 мин. Автоклавирование можно заменить выдержкой ёмкости со средой в кипящей водяной бане в течение 45 - 50 мин.
Фитогормоны стерилизовали путём пропускания их растворов через стерильный фильтр Millex GP (Millipore)с диаметром пор 0,22µm.
После соединения раствора фитогормонов с питательной средой смесь разливали в культуральную посуду, куда затем сажали фрагменты побегов картофеля.
2.1.2. Введение в культуру растений винограда
In vitro меристемы винограда получали введением в культуру почек, которые выделяли из проростков, полученных при проращивании зимующих черенков. Черенки нарезали в январе - феврале, после прохождения растениями вынужденного покоя, и хранили при температуре 0 - -5?C без света. Перед проращиванием черенки помещали в слабый раствор KMnO4 на 2 - 3 дня при Т=+30?C. Черенки проращивали при температуре 22±2?C, влажности 70 % и фотопериоде 12 ч день/12 ч ночь, до получения побегов с 4 - 6 междоузлиями.
Побеги срезали с черенков, удаляли листья, промывали дистиллированной водой. Стерилизацию побегов проводили в установках бокса.
Побеги помещали в 70 % этиловый спирт, после чего трижды промывали бидистиллированной водой, затем их выдерживали в 30 % водном растворе "Белизны" или "Domestos" в течение 15 мин, и промывали 3 - 4 раза бидистиллированой водой на протяжении 10 - 15 мин [39].
Почки винограда отделяли от побегов с помощью препаровальной иглы и помещали в колбы Эрленмейера с питательной средой на подложки из фильтровальной бумаги.
Меристемы винограда культивировали на питательной среде MS [146], состав среды такой, как и при культивировании картофеля.
После соединения раствора фитогормонов с питательной средой смесь разливали в культуральную посуду, куда затем сажали почки винограда.
2.2. Выращивание и размножение растений in vitro
Пробирки с фрагментами побегов помещали в фитотрон. Условия культивирования в фитотроне следующие: температура 20 - 25°С, влажность 70 %, освещённость 4 - 5 тыс. люкс, фотопериод: 16 час день / 8 час ночь.
Через 2 - 3 месяца вырастали ростки с четырьмя - семью междоузлиями с хорошо развитыми листьями. В большинстве случаев у побега есть также и корни. В случае инфицированности среды в пробирке с растением - это растение выбраковывали. Выросшие растения подвергали процедуре микроразмножения - разрезали на черенки с одним листочком и пазушной почкой. Микрочеренки снова высаживали в пробирки со свежей питательной средой на 30 - 40 дней для получения нового растения.
2.3. Вычленение меристем
Из проростков при помощи хирургических ланцетов или игл вычленяли пазушные меристемы под бинокулярным микроскопом МБС - 9, объектив ?14, увеличение ?98. Порядок вычленения: удаляли кроющие листья, раскрывая, таким образом, пазушную почку. После этого отсекали крупные листовые примордии, а оставшуюся часть почки - меристематическую верхушку с двумя листовыми примордиями, находящуюся в стадии формирования нового листового зачатка, - подрезали у основания и переносили в пробирки с жидкой питательной средой на подложки из фильтровальной бумаги или на поверхность агаризованой среды, для выращивания проростков.