ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили органные культуры, получаемые из щитовидных желез новорожденных поросят и половозрелых кроликов. Новорожденных поросят доставляли с Агрокомплекса "Слобожанский" Харьковской области, Чугуевского района, с. Граково. Самцы кроликов содержались в условиях вивария ИПК и К НАН Украины. Реципиентами для трансплантации служили субтотально тиреоидэктомированные кролики, которые к концу эксперимента достигали веса 2,5-3 кг.
2.1 Получение и культивирование органной культуры щитовидной железы кроликов и новорожденных поросят
Новорожденных поросят, под легким эфирным наркозом забивали при помощи гильотины. Экстирпацию щитовидных желез осуществляли в условиях стерильного бокса с соблюдением правил асептики и антисептики.
Культивирование осуществляли по стандартному методу [72, 104]. Щитовидные железы сразу после выделения помещали в стерильный 0,9% раствор NaCl с антибиотиками, в котором производили измельчение тиреоидной ткани на фрагменты 0,5-1 мм3. Полученные фрагменты щитовидных желез отмывали от крови стерильным 0,9% раствором NaCl, с последующей заменой раствора на среду культивирования. После замены среды образцы помещали в термостат при 37?С. Среда культивирования включала среду 199, 10% инактивированную телячью сыворотку и антибиотики широкого спектра действия (пенициллин - 100 ед/мл и канамицин - 150 ед/мл). Объем питательной среды нормировался на объем фрагментов, из расчета 5 мл среды на 0,5 мл суспензии фрагментов щитовидной железы. Культивирование органной культуры поводилось в течении 5-ти суток при температуре 37?С. Среду культивирования заменяли каждые 24 часа в условиях стерильного бокса.
2.2 Определение жизнеспособности органных культур щитовидной железы кроликов и новорожденных поросят
Для измерения количества жизнеспособных клеток органной культуры получали суспензию одиночных клеток [17, 18, 156, 175]. Для этих целей культуру инкубировали при постоянном перемешивании в течении 15 минут при температуре 37?С в 0,25% растворе трипсина (на среде 199) из расчета 1 часть ткани 3 части раствора. Трипсинизацию повторяли три раза. Все трипсинизаты с отделившимися клетками сливали в охлажденную до 4?С среду 199. Все трипсинизаты объединяли и дважды отмывали охлажденной средой 199, центрифугированием (1000 об/мин, 15 мин), процеживали через слой марли и повторно центрифугировали при том же режиме. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Клеточную суспензию окрашивали 0,1% трипановым синим в течении 7 минут. Далее для предотвращения агрегации суспезию клеток фиксировали в физиологическом растворе, содержащем 0,5% глутаровый альдегид. Удаление фиксирующего агента и избытка красителя производили двукратным отмыванием физиологическим раствором путем центрифугирования (1000 об/мин, 15 мин) до полного обесцвечивания надосадка. Разрушение клеток для выхода поглощенного ими красителя осуществляли 0,1N КОН. Измерение оптической плотности проводилось на ФЭКе (КФК-2-УХЛ42) при длине волны 595 нм. Контролем служило общее количество клеток, разрушенных 0,32% раствором уксусной кислоты. Параллельно определялось количество жизнеспособных клеток путем подсчета в гемоцитометре [1].
2.3 Определение гормональной активности органных культур щитовидной железы кроликов и новорожденных поросят
В среде культивирования и гомогенатах исследуемых образцов определяли содержание тиреоидных гормонов радиоиммунологическим методом при помощи наборов РИА - Т3, Т4-СТ, согласно прилагаемой инструкции. Для определения внутриклеточной фракции тиреоидных гормонов в нативных и криоконсервированных ОКЩЖ исследуемые гомогенаты центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин, полученные супернатанты подвергали радиоиммунологическим исследованиям.
Расчет содержания гормонов нормировали на белок, который определяли по стандартной методике Бредфорда [89].
2.4 Определение содержания нуклеиновых кислот в субклеточных фракциях органов животных
Количественное определение содержания нуклеиновых кислот осуществляли путем фракционирования по Шмидту и Тангаузеру с последующей спектрофотометрией [98]. Для определения содержания нуклеиновых кислот из ОКЩЖ, а так же исследуемых внутренних органов экспериментальных животных, готовили гомогенаты на среде 199 при помощи гомогенизатора Поттера. Все определения проводили на холоду. В центрифужные пробирки, содержащие 0,1 мл образца, добавляли 1,9 мл 0,3 М раствора HСlO4 и инкубировали при 0?С в течении 15 мин. Затем центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут. Осадки дважды отмывали 0,2 М раствором HСlO4 После последнего центрифугирования стенки пробирок тщательно высушивали фильтровальной бумагой. К осадкам добавляли 0,5 мл воды и суспендировали. К полученной суспензии при комнатной температуре добавляли 0,5 мл 0,6 М КОН, и инкубировали при 37?С в течении часа. По истечению указанного времени пробирки переносили на лед (для остановления гидролиза) и добавляли 2 мл 0,6 М HСlO4 и выдерживали 15 минут. Затем центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость собирали. В полученном надосадке определяют содержание РНК, которое рассчитывали в мкг на 1 мл надосадочной жидкости. Расчет производили по формуле
СРНК=D270 - D290? 10,50,19
Количество РНК нормировали на массу ткани. В оставшихся после щелочного гидролиза образцах определяли содержание ДНК. Для этого к осадку добавляли 3 мл 0,5 М HСlO4 и осуществляли гидролиз на кипящей водяной бане в течении 20 минут. Количество ДНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Unicam SP 8000при ?=270 и 290 нм и рассчитывали в мкг на 1 мл надосадочной жидкости определяли по формуле
СДНК=D270 - D290? 10,10,19Количество ДНК нормировали на массу ткани.
2.5 Гистологические исследования
Гистологическому исследованию подвергались, 5-ти дневные, криоконсервированные и рекультивированные органные культуры щитовидных желез кро