РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
С целью решения поставленных задач в работе были использованы В работе были использованы морфологические, биохимические методы, методы оценки реологических показателей, метод спектрального анализа вариабельности ритма сердца, методы иммуноферментного анализа и прижизненной биомикроскопии.
В экспериментах использовался разрешенный Министерством охраны здоровья Украины препарат Криоцелл-криоэкстракт плаценты (сертификат ГР №604/06-300200000). В состав КЭП входят такие биологически активные вещества: ?-фетопротеин - 429±75 мМЕ/мл; хорионический гонадотропин - 26,8±8 мМЕ/мл; эстрадиол - 755±48 пМоль/мл; прогестерон - 226±110 нМоль/мл; пролактин - 705±129 мМЕ/мл; ?-микроглобулин фертильности - 1470±173 нг/мл; СТГ - 5,64 нг/мл; лютеинизирующий гормон - 7,8±1,9 МЕ/л; фолликулостимулирующий гормон - 7,1±2,3 мМЕ/л; ТТГ - 291±13 мМЕ/л; фактор некроза опухоли - 84,5 пкг/мл; тестостерон - 3,68±1,06 нМоль/мл; кортизол - 1395±515 нМоль/мл; общий белок - 76,5±14 мг/1г веса.
Эксперименты проведены на половозрелых беспородных крысах-самцах (6 мес.) массой 180-220 г (197 животных), содержащихся в стандартных условиях вивария ИПКиК НАН Украины.
Животные были разделены на 4 группы:
1 группа- интактные животные (контроль);
2 группа- крысы, которые подвергались общему охлаждению;
3 группа- животные, которым внутрибрюшинно одноразово в течение 5-ти дней вводили КЭП, доза которого составляла 0,1мл/100г массы животного;
4 группа- крысы, которым предварительно вводили КЭП, а затем через сутки после введения подвергали действию холода.
Все манипуляции с животными проводили, соблюдая положения Европейской конвенции по охране позвоночных животных и национального законодательства по гуманному обращению с животными (Страсбург, 1986).
2.1. Метод общего охлаждения
Общее охлаждение лабораторных животных осуществлялось в водяной бане при температуре воды +4?С, где животное плавало, не имея возможности опираться на стенки и дно бассейна. Температура воздуха составляла +13-14?С. Животных извлекали в момент, практически близким к потоплению. Крысы помещались в водяную баню без предварительной адаптационной подготовки к воздействию холодового стресса. В силу значительных двигательных артефактов электрическую активность сердца регистрировали после извлечения животных из воды. В процессе проведения методики осуществлялся контроль ректальной температуры до и после охлаждения с помощью термометра, а также регистрировалось время плавания крыс.
2.2. Регистрация электрокардиограммы и спектральный анализ показателей вариабельности сердечного ритма.
Электрокардиограммы регистрировались на электорокардиографе серии "Поли-Спектр" в 6-ти стандартных отведениях. Спектральный анализ показателей вариабельности сердечного ритма (ВСР) проводили с помощью программы "Поли-Спектр-Ритм".
Спектральный анализ ритма сердца заключался в идентификации его волновой структуры путем разделения каждой исходной кривой на набор кривых, которые находятся в своем частотном диапазоне [53]. Согласно основной системе спектрального анализа ВСР нами были выделены и проанализированы следующие показатели:
ТР, (мс2)-полная мощность спектра колебаний кардиоритма ( 0,003-0,4 Гц). Она отражает суммарную активность нейрогуморальных влияний на сердечный ритм.
HF, (мс2)-высокочастотные колебания (0,15-0,4 Гц). Мощность в этом диапазоне связана преимущественно с дыхательными движениями и отражает вагусный контроль сердечного ритма (колебания парасимпатического отдела вегетативной нервной системы).
LF, (мс2)-низкочастотные колебания (0,04-0,15Гц). На мощность в этом диапазоне оказывают влияние изменения тонуса как симпатического (преимущественно), так и парасимпатического отдела вегетативной нервной системы.
VLF, (мс2)-мощность спектра кардиоритма в области сверх низких частот (0,003-0,04Гц). Физиологическими факторами, влияющими на этот диапазон частот, являются, предположительно, ренин-ангиотензин-альдостероновая система, концентрация катехоламинов в плазме, система терморегуляции и др.
LF/HF- этот показатель характеризует баланс симпатических и парасимпатических влияний на сердечный ритм.
2.3. Изучение реологических свойств крови.
Динамическую вязкость крови определяли на капиллярно-рамочном вискозиметре типа Копли [99] в модификации при напряжениях сдвига 2.85; 3,80; 5,70; 7,60; 9,50 дин/см?, которые характерны для различных отделов микроциркуляторного русла и могут служить моделью кровотока в микроциркуляторном русле. В вискозиметре использовали капилляр с радиусом в узкой части 0,38мм и длиной 98,0мм, радиус широкой его части составлял 0,78мм. Калибровку прибора проводили 40%-ным раствором сахарозы.
Величину динамической вязкости определяли по формуле:
?= 100gr4/ 8R?lz Pt (сП),
где r- радиус капилляра в узкой части (см), l- длина узкой части капилляра (см), R- радиус капилляра в широкой части (см), z- расстояние, проходимое мениском по широкой части капилляра (см), t- время (сек), Р - давление в системе, ?- вязкость (сП)
2.4. Определение гематокритного числа.
Гематрокритное число- это отношение объема эритроцитов крови к объему плазмы.
Для определения этой величины использовался микрометод с применением капилляра Панченкова, который ополаскивали антикоагулянтом (гепарин), затем набирали кровь точно до отметки 0. Капилляр с кровью центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Затем отмечали количество делений, занимаемых столбиком из эритроцитов, в результате вычисляли гематокритное число в процентах [71].
2.5. Метод изучения микрогемоциркуляции в организме экспериментальных животных.
Для изучения микрогемоциркуляции была выбрана витальная микроскопия, позволяющая оценить скорость кровотока, диаметр и характер контуров внутренней и наружной