ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом исследования служила кровь лошади, быка и собаки, заготовленная на
консерванте «Глюгицир». Все животные были здоровыми, половозрелыми самцами.
Животные были иммунизированы, свободны от паразитов. Кровь у лошади (5-13 лет)
и быка (2-4 года) забирали из яремной вены, у собаки (2-10 лет) из плечевой
вены путем венопункции [?40].
2.1. Получение эритроцитов
Для удаления плазмы и лейкоцитов кровь центрифугировали 3-4 мин при 1200 g.
Осадок эритроцитов трижды отмывали изотоническим раствором NaCl (150 мМ NaCl,
10 мМ фосфатный буфер, рН 7.4). Гематокрит составлял не менее 95% для всех
видов эритроцитов.
2.2. Обработка эритроцитов криопротекторами и замораживание-отогрев
Для криоконсервирования эритроцитов животных были использованы следующие
криоконсерванты:
1. ЦОЛИПК 114, содержащий 30% глицерин, 4% маннит; 0,7% NaCl; 0,03%
Na2HPO4*12H2O, рН 7.4 [?1];
2. 20% ДМСО; 0,9% NaCl; 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4 [?63];
3. 30% ПЭО-1500, 0.9% NaCl, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7.4 [?4, ?63]. После
приготовления раствор ПЭО-1500 выдерживали при 220С 24 часа [?80].
При криоконсервировании эритроцитов животных под защитой ПЭО-1500, исследовали
два температурных режима инкубации с криопротектором при температурах 0-4 и
22-24 0С. Раствор ПЭО-1500 вводили в клеточную суспензию путем добавления
равного объема криоконсерванта порциями через каждые 4 мин по каплям с
постоянным перемешивании в течение 40 мин (дозированное добавление).
Проникающие криопротекторы добавляли к эритроцитам при комнатной температуре в
соотношении 1:1 (по объему) по каплям со скоростью около 10 мл/мин и
выдерживали определенное время, экспериментально подобранное для каждого вида
животного.
Взвесь клеток замораживали в стандартных алюминиевых контейнерах ЦНИИГПК
объемом 10 мл. Замораживание осуществляли до температуры -196 0С путем быстрого
погружения контейнера в жидкий азот. Оттаивание производили на водяной бане при
температуре 42-44 0С с постоянным покачиванием контейнера.
2.3. Удаление проникающих криопротекторов из клеток
При использовании проникающих криопротекторов после размораживания проводили
троекратное отмывание эритроцитов согласно стандартным (для эритроцитов
человека) методикам [?68]. Суспензию эритроцитов с криопротектором
центрифугировали, надосадок удаляли и к осадку добавляли равный объем первого
отмывочного сахарозно-солевого или солевого отмывочного растворов. После
центрифугирования к осадку добавляли равный объем второго отмывочного
сахарозно-солевого или солевого растворов с последующим центрифугированием в
течение 5 мин. при 1200 g. Третье отмывание сахарозно-солевым или солевым
растворами проводили аналогичным образом. Схема отмывания представлена в
таблице 2.3.1.
Таблица 2.3.1
Схема удаления проникающего криопротектора из суспензии эритроцитов
Сахарозно-солевая
среда [?225]
Солевая среда [?68]
Первый раствор
30,0% сахарозы,
0,7 % NaCl,
10 мМ фосфатного буфера,
рН 7,4
0,6 М NaCl,
10 мМ фосфатного буфера,
рН 7,4
Второй раствор
10,0 % сахарозы,
0,7 % NaCl,
10 мМ фосфатного буфера,
рН 7,4
0,15 М NaCl,
10 мМ фосфатного буфера,
рН 7.4
Третий раствор
5,0% сахарозы,
0,9% NaCl,
10 мМ фосфатного буфера,
рН 7,4
0,15 М NaCl,
10 мМ фосфатного буфера,
рН 7,4.
2.4. Моделирование трансфузии
Моделирование трансфузии после криоконсервирования осуществляли перенесением
клеток в изотонический раствор NaCl, содержащий 10 мМ фосфатного буфера, рН
7,4, или в аутоплазму при 37 єС. Разведение эритроцитов составляло 1:10 в
соответствие с установленными процедурами трансфузии крови реципиентам.
Инкубацию проводили в течение 24 часов с отбором аликвот через определенные
интервалы времени (1, 2, 4 и 24 часа), что позволяет отследить изменения
устойчивости криоконсервированных клеток после возвращения их в физиологические
условия.
2.5. Осмотическая хрупкость
Осмотическую хрупкость определяли по методу [?73], оценивая устойчивость клеток
в гипотонических растворах NaCl в интервале от 0,1% до 0,9%. Индекс
осмотической хрупкости определяли как концентрацию NaCl, при которой происходит
50%-ный гемолиз. После криоконсервирования эритроцитов в присутствии
неппроникающего криопротектора ПЭО-1500 трижды отмывали изотоническим раствором
NaCl.
2.6. Определение уровня гемолиза эритроцитов
Гемолиз определяли по содержанию свободного гемоглобина в супернатанте
спектрофотометрическим способом на СФ-46 (ЛОМО, Россия) при длине волны 543 нм
[?29].
2.7. Способ определения коэффициента проницаемости эритроцитов для
криопротекторов
Способ измерения коэффициентов проницаемости эритроцитов для криопротекторов
основан на физико-математической модели гипотонического гемолиза эритроцитов,
изложенной в [?23, ?24, ?131]. В этих работах получено соотношения, которые
полностью описывают кинетику гемолиза эритроцитов в гипертоническом водном
растворе проникающего в клетку вещества. Количественные результаты построенной
модели лежат в основе алгоритма расчета коэффициента проницаемости эритроцитов
для криопротекторов по зависимости интенсивности рассеянного суспензией
эритроцита света от времени в процессе гипотонического гемолиза [?26].
Построенная физико-математическая модель связывает время tЅ , за которое из
эритроцита выходит 50% от начального количества в нем гемоглобина с
коэффициентом проницаемости клеточной мембраны к растворенному во внеклеточном
растворе криопротектора:
(2.1)
где S - площадь поверхности клеточной мембраны,
V - объем эритроцита,
Kc - коэффициент проницаемости мембраны эритроцита для криопротектора.
Вр
- Київ+380960830922