ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Получение эритроцитов
Эритроциты получали из свежеконсервированной донорской крови, заготовленной на глюгицировом консерванте. Кровь получали на Харьковской областной станции переливания крови. С целью унификации объекта, в работе использовали кровь II группы. После удаления плазмы эритромассу трижды отмывали путем центрифугирования при 1500 g в течение 3 мин в 10-кратном объеме физиологического раствора
(0,15 Моль/л хлорид натрия, 0,01 Моль/л трис-буфер, pH 7,4). Лейкоцитарную пленку и супернатант удаляли методом аспирации. Осадок эритромассы содержал в среднем 80 % клеток. Эритроциты в виде плотного осадка хранили при 4 ?С и использовали в течение 4 часов.
Гипертонический криогемолиз эритроцитов
Эритроциты с конечным гематокритом 2 % добавляли в растворы, содержащие:
>1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза;
>(1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза)+20 %-й ПЭГ-3000;
>(1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза)+20 %-й ПЭГ-1500;
>(1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза)+5 %-й ПЭГ-400;
>(1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза)+5 %-й глицерин;
>(1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза)+5 %-й 1,2-пропандиол;
>(1,2 Моль/л хлорид натрия или 0,86 Моль/л сахароза)+5 %-й ДМСО;
инкубировали 0-60 минут при 37 оC и охлаждали на ледяной бане 10 минут. Для холодовой предобработки эритроцитов ПЭГ-1500 (цикл 0 - 37 - 0 оС) перед вышеописанной процедурой, клетки инкубировались 15 мин при температуре 0 оС. Для насыщения эритроцитов проникающими криопротекторами (глицерин, 1,2-пропандиол, ДМСО, ПЭГ-400) клетки предварительно инкубировали в растворе, содержащем 0,15 Моль/л хлорида натрия и 5 %-й раствор соответствующего криопротектора в течение 30 минут при 37 оС. После охлаждения пробирки с суспензией эритроцитов центрифугировали при комнатной температуре 3 минуты, 1500 g. Все экспериментальные среды были приготовлены на 10 Ммоль/л трис-буфере (рН 7,4).
Определение уровня гемолиза эритроцитов спектрофотометрическим методом.
Клетки осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 1500 g. Содержание вышедшего в супернатант гемоглобина определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-4А с проточной кюветой при длине волны 543 нм. За 100 % принимали поглощение пробы, в которую добавляли детергент тритон Х-100 в концентрации 0,1 %.
Исследование котранспорта Н+-SO42- в эритроциты методом рН-метрии.
Эритроциты человека получали из донорской крови путем отмывания растворами:
>0,15 моль/л NaCl, 10 ммоль/л трис (рН 7.4),
>0,15 моль/л NaF, 10 ммоль/л трис (рН 7.4)
трижды по 10 минут при 37 ?С. Полученные хлорид и фторид-содержащие эритроциты использовали в экспериментах на рН-метре, сопряженным с самописцем и термостатируемой ячейкой с рН-электродом. Исследовали обмен внутриклеточных анионов хлорида и фторида на внеклеточный сульфат в эритроцитах, внесенных в ячейку, содержащую 0,12 моль/л Na2SO4.
Степень ингибирования дипиридамолом вычисляли по формулам :
K=ln10( ? pH/ ? t),
%ингибирования=(1-КДИП/ККОНТ)100%,
где КДИП и ККОНТ константы скорости входа ионов Н+ соответственно в присутствии и отсутствии дипиридамола. Эритроциты (2 %-й гематокрит) обрабатывали дипиридамолом в концентрациях 25, 50, 100, 200 мкМоль/л 10 минут в безбуферной среде, содержащей 0,15 моль/л NaCl, и осаждали без отмывания ингибитора.
Изучение скорости транспорта Н+ в эритроцитах
При анализе скорости транспорта Н+ в эритроцитах методом рН-метрии в термостатируемую ячейку помещали по 2 мл раствора 0,12 мМоль/л сульфата натрия (37 оС), доводили рН раствором гидроокиси натрия до уровня внутриклеточного рН (6,9-7,1), после чего в ячейку вносили по 50 мкл эритромассы с конечным 2 %-м гематокритом и производили измерение изменения рН. Далее в ячейку вносили ингибитор анионного транспорта дипиридамол в различных концентрациях (5-200 мкМоль/л). Запись изменений рН суспензии эритроцитов производили с помощью рН-электрода на самописце Эндим (ГДР).
Обмен внутриклеточного хлорида на внеклеточный сульфат в незабуференной среде сопровождается последовательно фазой закисления и фазой защелачивания суспензии эритроцитов [208].
Используя экспериментальные параметры tмакс, можно рассчитать константы и .[45]
и - константы транспорта анионов соответственно внутрь и из клетки, а tмакс, , , макс - параметры, определяемые из экспериментальных рН-кривых:
Исследование динамической структуры мембран эритроцитов.
Динамическую структуру мембраны эритроцитов изучали методом ЭПР спиновых зондов [26]. В работе был использован зонд, который представляет собой производное жирной кислоты, содержащий нитроксильный радикал 16-ДС ("Sigma"). В молекуле 16-ДС нитроксильный фрагмент присоединен к 16-му атому углеводородной цепи, что позволяет использовать зонд 16-ДС для изучения структурного состояния гидрофобной зоны мембраны на расстоянии примерно 16 углеродных атомов вглубь бислоя.
Спин-меченая суспензия клеток содержала 100 мкМоль/л жирнокислотного зонда, предварительно растворенного в этиловом спирте (концентрация спирта в суспензии клеток не превышала 1 %). Указанную концентрацию зонда считают магнитно-разбавленной (присутствуют единичные зонды, не взаимодействующие друг с другом) и не пертурбирующей клеточную мембрану [26].
Контрольные, а также обработанные сульфгидрильными реагентами клетки инкубировали с зондами в течение 20 мин, т.к. показано, что за это время завершается встраивание молекул спиновых зондов в бислой [26].
Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре "Bruker" ER 100D (ФРГ) в Х-диапазоне (9,4 ГГц) с частотой модуляции 100 кГц, временем сканирования 100 сек (диапазон сканирования 200 Гс) и постоянной времени 2 мсек с использованием стандартной термоприставки (точность термостатирования ±0,5 оС). Параметр вращательной подвижности зонда, рассчитывали из отношения высокопольн