Раздел 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для решения поставленных задач применялись методы световой микроскопии, криомикроскопии и физико-математического моделирования криобиологических процессов, оценки состояния клеток с помощью суправитального окрашивания, оценки адгезивной способности и фагоцитарной активности.
Исследования проводились на ядросодержащих клетках костного мозга мыши и кордовой крови человека. В исследованиях кинетики осмотических реакций клеток в растворах криопротекторов и солей использовались диметилсульфоксид (ДМСО), 1,2 - пропандиол (1,2-ПД), глицерин и хлорид натрия.
2.1 Получение суспензий ядросодержащих клеток костного мозга и кордовой крови
Клетки костного мозга мыши представляют собой гетероморфную клеточную суспензию, диаметр клеток в которой варьирует от 5 до 20 мкм. Костномозговую суспензию получали из бедренных костей костей мышей линии (CBA?C57Bl) F1 возрастом 8-12 недель путем вымывания 199 средой. После 10 кратного ресуспендирования клетки выдерживались 5 минут для осаждения конгломератов и затем сразу же использовались в эксперименте. Осмотический ответ оценивался для мононуклеаров диаметром 8-10 мкм, которые включают в себя гемопоэтические клетки предшественники, лимфоидные клетки, базофильные, оксифильные и полихроматофильные нормобласты [159].
Ядросодержащие клетки кордовой крови человека, использованные в работе, выделяли из цельной кордовой крови, полученной из 5-го роддома и Железнодорожной поликлиники города Харькова. Все действия и исследования осуществлялись в течение 24 часов после родов, такой срок не влияет на жизнеспособность клеток до начала экспериментов [8]. Суспензию, обогащенную ядросодержащими клетками получали с использованием метода ускоренного осаждения эритроцитов в коллоидных растворах низкой плотности [160-162], что возможно благодаря различной удельной плотности плазмы, ядросодержащих клеток и эритроцитов [160]. В качестве коллоида применялся раствор желатина, который позволяет получить фракцию ядросодержащих клеток с небольшим содержанием эритроцитов без существенной потери их жизнеспособности [161]. Раствор для ускоренного осаждения эритроцитов также содержал глюкозу, сахарозу, ЭДТА натрия, цитрат натрия, хлорид натрия. Присутствие ЭДТА натрия позволяет существенно ускорить осаждение эритроцитов, т.к. данное вещество - "комплексон", образует с связи с катионами кальция и магния, что объясняет его антикоагуляционную способность и характер воздействия на скорость оседания эритроцитов [163]. Цитрат натрия препятствует агрегации клеток. Получение суспензии ядросодержащих клеток осуществлялось следующим образом (рис. 2.1).
Рис. 2.1. Схема процедуры получения суспензии, обогащенной ядросодержащими клетками кордовой крови
Цельную кордовую кровь наслаивали на раствор желатина в химической пробирке, соотношение крови и раствора 1:2, затем пробирку осторожно встряхивали для смешивания слоев ставили на водяную баню температурой 23?С на 60 минут. В течение этого времени происходило разделение суспензии на три слоя: плазма, плазма с ядросодержащими клетками и небольшим количеством эритроцитов и эритроцитарный осадок. После разделения осторожно отбирали супернатант с помощью пастеровской пипетки и центрифугировали на лабораторной центрифуге в течение 5 минут при 1000 об/мин. Затем надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 199 среде.
2.2. Микроскопия
Исследования проводились на поляризационно-интерференционном микроскопе МПИ-5, включенном в микрокиноустановку МКУ-3, что позволяло регистрировать процессы, протекающие в изучаемом образце в процессе наблюдения.
Для осуществления наблюдения и съемки с момента начала взаимодействия исследуемых растворов с клетками была изготовлена специальная камера (рис. 2.2, а), представляющая собой предметное стекло с покровными стеклами, наклеенными на него таким образом, чтобы образовывать углубление размерами 0,5х2см. 1 мкл суспензии наносили на покровное стекло, которое затем помещали на камеру таким образом, чтобы оставалось отверстие для внесения раствора (рис. 2.2, б).
После этого камеру с клетками помещали под микроскоп. Затем в отверстие вносили 30 мкл исследуемого раствора с одновременным включением кинокамеры и секундомера. Раствор втягивался в содержащую клетки камеру под действием капиллярных сил.
2.3. Исследование осмотической реакции ядросодержащих клеток костного мозга и кордовой крови в растворах электролитов и криопротекторов. Определение относительного объема клеток. Определение осмотически неактивного объема клеток.
Плазматические мембраны клеток обладают избирательной проницаемостью. Поэтому, при переносе в растворы осмотически активных веществ, клетки изменяют свой объем пропорционально осмотическому давлению среды. Скорость изменения объема клетки при данной температуре определяется значениями коэффициентов проницаемости плазматической мембраны клеток для воды и проникающих веществ и геометрическими параметрами клеток.
Относительный объем клеток V(t)/V(0) , где V(t) - объем клетки в момент времени t, V(0) - объем клетки в начальный момент времени определялся путем анализа фотографических изображений клеток, полученных с помощью кинокамеры. Клетки апроксимировались эллипсоидами с полуосями a и b, измеряя полуоси получали изменение относительного объема. Следует отметить, что при анализе использовали клетки, изотропно изменявшиеся в объеме.
Для определения осмотически неактивного объема ?, объемы отдельных клеток были измерены после однократного разведения суспензии растворами NaCl с осмоляльностью 285, 600, 1000 и 1200 мОсм/кг при 18?C. Объемы эквилибрированных клеток были отнесены к их изотоническому объему и затем нанесены на график зависимости от обратной относительной осмоляльности (график Boyle van't Hoff). Была определена линейная регрессия для подгонки уравнения Boyle