РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект и условия эксперимента
Эксперименты были проведены на 180 беспородных белых крысах согласно "Загальних принципів експериментів на тваринах" одобренных
I Национальным конгрессом по биоэтике (20.09.04 г., Киев, Украина), а также в соответствии с положениями "Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" [117]. Все оперативные вмешательства на животных, включая декапитацию, проводили под ингаляционным эфирным наркозом.
В работе были использованы 38 эмбрионов белых беспородных крыс 12-14 суток гестации, из которых выделяли соматические эмбриональные клетки.
В отдельной серии экспериментов были использованы фрагменты покровной и мышечной тканей от 7 эмбрионов человека 8-11 недель гестации, полученные после планового прерывания беременности при наличии информированного письменного согласия донора на использование данного биоматериала для исследований в соответствии с требованиями этической комиссии ИПКиК НАН Украины.
2.2. Подготовка биологического материала для исследования
Метод выделения соматических эмбриональных клеток (СЭК) включал в себя два этапа: на первом этапе определяли стадию эстрального цикла у самок крыс методом микроскопии вагинальных мазков для выявления животных, готовых к оплодотворению (стадия эструса) [24]. Затем самок крыс подсаживали к самцам и проводили контроль вагинальных мазков. Первым днем беременности считали день обнаружения в мазках спермиев и с этого момента отсчитывали срок гестации. На 12-14 день предварительно анестезированных беременных самок крыс декапитировали, вскрывали брюшную полость, извлекали рога матки, содержащие эмбрионы, и помещали в стерильный растовор Хенкса. Затем эмбрионы промывали и переносили в чашку Петри для препарирования. С помощью пинцета и глазных ножниц выделяли покровные и мышечные ткани, очищали от кровяных сгустков, измельчали на фрагменты размером 1-2 мм3 и помещали в 0,25%-й раствор трипсина [10]. Ферментативную обработку ткани проводили в различных условиях: при 37?С в течение 40 минут; при 20?С в течение 1 часа, 3 часов и 6 часов; при 5?С в течение 6 и 20 часов, после чего подвергали механической дезинтеграции в растворе Хенкса. Полученную клеточную взвесь фильтровали через систему ПК-12-02 для удаления не раздиссоциированных фрагментов ткани; определяли количество клеток, выделенных из 1г ткани, а также проверяли их сохранность.
Криоконсервирование суспензии СЭК проводили на программном замораживателе "Сryoson" с использованием трехэтапной программы замораживания с начальной скоростью 1?С/мин от 0?С до -40?С; 10?С/мин от -40?С до -80?С с последующим погружением в жидкий азот [17]. Средой замораживания служил раствор Хенкса с добавлением 2, 5 или 10% одного из криозащитных веществ - ДМСО, полиэтиленоксида с молекулярной массой 1500 (ПЭО-1500) или эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота. В ряде экспериментов использовали криозащитные среды, включающие смеси вышеуказанных компонентов. Растворы криопротекторов медленно добавляли к суспензии клеток, смешивали в соотношении 1:1, инкубировали в течение 15-20 минут при комнатной температуре (20-21?С). Отогрев клеточной суспензии проводили непосредственно перед началом эксперимента на водяной бане при 37°С до полного оттаивания. Перед экспериментом суспензию СЭК отмывали раствором Хенкса.
В работе также были использованы летально криоповрежденные клетки, полученные путем быстрого замораживания суспензии погружением в жидкий азот в отсутствии криопротектора и последующего быстрого отогрева при 37°С.
Сохранность суспензии СЭК крыс до и после криоконсервирования определяли методом суправитального окрашивания трипановым синим [187]. Для этого к суспензии добавляли 0.9% NaCl в соотношении 1:1, а затем инкубировали с 0.3% раствором трипанового синего (1:1) в течение 5 мин и подсчитывали количество сохранных клеток, которые не окрашивались красителем. Подсчет клеток проводили в камере Горяева, параллельно определяя концентрацию клеток по стандартной методике [35]. В работе использовали суспензию СЭК, исходная сохранность клеток в которой составляла не менее 80-85 %.
Культивирование СЭК проводили в течение 3 суток в стандартных условиях [32]. При этом оценивали способность клеток к адгезии, распластыванию и делению.
2.3. Экспериментальные модели
В зависимости от поставленных задач формировали следующие модели травматических повреждений у крыс:
- моделирование дефекта коленного сустава проводили путем артротомии коленного сустава, для чего в области межмыщелковой борозды стоматологическим бором наносили остеохондральный дефект диаметром 2 мм и глубиной 2 мм [25]. В полость дефекта сразу после травмы вводили фрагмент коллагеновой губки ("Collagen-Implant-Braun", Германия), объемом ? 3,5 мм3, содержащей СЭК в количестве 1 - 2?106 клеток/мл. После этого рану ушивали и животных содержали в стандартных условиях вивария. На 21-е сутки после травмы и введения суспензии свежеизолированных или криоконсервированных СЭК животных выводили из эксперимента;
- модель глубокого ожога [74] была сформирована у крыс путем прикладывания на кожу бедра животных в течение 10 сек разогретой до 200?С металлической пластинки размером 2,5?2,5 см2. Данный метод позволяет получить стандартные по площади ожоги на глубину всех слоев кожи [30].
Для фиксации СЭК в зоне дефекта кожи через 24 часа после ожога на зону термического повреждения наносили 1 мл метилцеллюлозного геля [1], содержащего 2?106 клеток/мл СЭК.
Независимо от использованной модели травматического повреждения крысы были разделены на 5 групп:
группа 1- контроль; самопроизвольное заживление раны;
группа 2 - контроль с фиксирующим клетки носителем;
группа 3 - животным вводили суспензию свежеизолированных СЭК крыс в соответствующем носителе в дозах, описанных выше.
группа 4 - животным