Ви є тут

Чутливість кровотворних клітин-попередників ембріональної печінки людини до дії факторів низькотемпературного консервування

Автор: 
Тарасов Андрій Ігорович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2003
Артикул:
0403U002170
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общие процедуры

2.1.1. Рабочие растворы. Для разделения клеток в градиенте Percoll, отмывания клеток от моноклональных антител и изучения кинетики осмотической реакции приготавливались следующие растворы:
Буферный раствор на основе HEPES (табл. 2.1) содержал три компонента. Навески растворялись в 1 л бидистиллированной воды, pH раствора доводилось до значения 7,4 концентрированным раствором NaOH.
Таблица 2.1
Компоненты буферного раствора
КомпонентМол. массаМасса в растворе, гКонцентрация, моль/лHEPES2382,380,01KCl74,50,201150,0054MgSO4?7H2O2460,04920,0004
Концентрированный солевой раствор: 4,197 г NaCl растворялось в 0,1 л буферного раствора. Концентрация NaCl составляла, таким образом, 0,815 моль/л.
Солевой раствор №1 содержал 2% БСА: в 19 мл концентрированного раствора добавлялось 0,2 г БСА, после чего объём доводился до 100 мл буферным раствором.
Солевой раствор №2 содержал 2% БСА и 0,02 моль/л NaN3: 0,13 г NaN3 растворялось в 16 мл концентрированного раствора, объём доводился до 100 мл буфером №1, с добавлением 0,2 г БСА.
2.1.2. Выделение и криоконсервирование суспензии клеток ЭПЧ. Эмбрионы человека были получены после хирургического прерывания беременности по "социальным" показаниям. Суспензию клеток эмбриональной печени получали в стерильных условиях неферментативным методом [180], фильтровали и пропускали через иглы уменьшающегося диаметра (19G - 25G). Полученная таким образом суспензия использовалась для исследования либо консервировалась.
Материал криоконсервировался в 2-мл пластиковых контейнерах (Nunc). Для замораживания использовалась бессывороточная среда на основе сахарозы [181], в качестве криопротектора использовался ДМСО в концентрации 5% (0,7 моль/л). Криопротектор добавлялся медленно пошагово при температуре +4?С. Охлаждение производилось по трёхступенчатому протоколу: после добавления ДМСО и эквилибрации в течение 20 минут при +4?С клетки охлаждались до -40?С со скоростью 1?С/мин. От -40?С до -80?С клетки охлаждались со скоростью 10?С/мин, после чего погружались в жидкий азот. Отогрев образцов производился на водяной бане при +37?C.
Для циклического замораживания-отогрева криоконтейнеры с одинаковым объёмом суспензии ЭПЧ помещались на лёд (+4?С); со льда они переносились непосредственно в жидкий азот (-196?С), после чего производился быстрый отогрев. В результате достигалась скорость охлаждения порядка 200?С/мин. Образцы подвергались 4-м циклам быстрого замораживания отогрева. После каждого цикла замораживания-отогрева аликвоту суспензии отбирали для определения жизнеспособности и объёма клеток.
2.1.3. Определение жизнеспособности суспензии клеток ЭПЧ. Определение жизнеспособности суспензии клеток ЭПЧ до и после криоконсервирования проводилось по окрашиванию (1:1) 0,2% раствором трипанового синего. Доля ядросодержащих клеток определялась с помощью обработки суспензии 3%-ным раствором уксусной кислоты. Подсчёт клеток производился в лабораторном гемоцитометре. Число клеток N в 1 мл определялось по формуле:

, (2.1)

где Nc - число клеток в гемоцитометре,
Vc - объём гемоцитометра (0,4х10-3 мл),
k - разведение (выбиралось в диапазоне 50 - 100).
Жизнеспособность суспензии определялась по формуле:

(2.2.а)

При анализе результатов циклического замораживания-отогрева для исключения вклада лизиса клеток в процессе замораживания-отогрева, а, также учитывая, что измерения проводились на одном и том же образце, определяли относительную жизнеспособность - отношение содержания жизнеспособных (неокрашивающихся) клеток в единице объёма исследуемой суспензии к исходному их содержанию:
(2.2.б)
Для определения жизнеспособности суспензии клеток ЭПЧ методом проточной цитометрии использовалось окрашивание пропидиум иодидом (PI).
2.1.4. Разделение клеток в градиентах плотности. Для обогащения суспензии клеток ЭПЧ мононуклеарами применяется центрифугирование в градиентах гидроксиэтихкрахмала, Ficoll, Percoll и Hystopaque [182, 95], использование агентов, лизирующих эритроциты, может привести к потерям среди популяции ККП [183]. В данной работе использовалось изопикническое центрифугирование в градиентах плотности Hystopaque или Percoll. При центрифугировании в градиенте Hystopaque 5 мл суспензии клеток наслаивали на 3 мл градиента в центрифужной пробирке и центрифугировали в течение 20 минут при 800?g. Обогащённую суспензию собирали со ступени плотностью ? = 1,077 пастеровской пипеткой и отмывали двукратным центрифугированием в RPMI-1640 в течение 15 минут при 600?g и в течение 10 минут при 450?g.
Для приготовления изотонического раствора Percoll ("isoPercoll") чистый Percoll разбавлялся 4:1 концентрированным солевым раствором. Ступени плотности ? = 1,077 и ? = 1,050 получали при смешивании isoPercolla с солевым раствором №1 в соотношениях 6:4 и 4:6 соответственно. Percoll с плотностью ? = 1,077 использовался аналогично градиенту Hystopaque. Для удаления нежизнеспособных клеток из суспензии на ступень плотностью ? = 1,077 наслаивали дополнительную ступень Percoll плотностью ? = 1,050. После центрифугирования нежизнеспособные клетки удалялись.

2.2. Иммунофенотипирование и культивирование

2.2.1. Моноклональные антитела. Для маркировки различных популяций гемопоэтических клеток в работе использовались следующие моноклональные антитела (мышиные против антигенов человека), конъюгированные с флуоресцеин изотиацианатом (FITC), фикоэритрином (PE), а также неконъюгированные: CD34-PE/FITC (клон QBend10, Beckman Coulter), CD45-FITC (клон J33, Beckman Coulter), CD133-PE (клон AC133, Miltenyi Biotech), Glycophorin-A-FITC (DAKO). Также использовались моноклональные антитела производства фирмы Медбиоспектр (Москва, Россия): CD1 (ICO-44), СD10 (ICO-124), CD13 (ICO-217), CD34 (ICO-115), CD5-FITC (ICO-80), CD7-FITC (ICO-87), CD20-PE (ICO-180), CD38-