РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект и условия эксперимента
Для исследований были использованы криоконсервированные клетки эмбриональной
печени человека разных сроков низкотемпературного хранения и бесклеточный
цитозоль мягких тканей эмбрионов, которые вводили животным с разными формами
печеночной недостаточности.
Эмбрионы человека 8-10 нед гестации были получены после письменного соглашения
донора в результате планового прерывания беременности. Клетки эмбриональной
печени были выделены из эмбрионов в условиях стерильного бокса, как описано
[67].
Криоконсервирование суспензии клеток эмбриональной печени проводили по 3-х
этапной программе замораживания с начальной скоростью 1 єС/мин до – 40 єС, 10
єС/мин от – 40 єС до –80 єС с последующим погружением в жидкий азот. Среда
криоконсервания содержала 250 мМ сахарозы, 5 мМ KCl, 1.6 мМ Na2HPO4, 0.4 мМ
KH2PO4, 0.8 мМ MgCl2, 1.2 мМ CaCl2 (pH 7.4) и 5 % ДМСО. Хранение ККЭП
осуществляли при –196 °С в условиях низкотемпературного банка ИПКиК НАНУ от 1
до 120 нед.
Жизнеспособность суспензии клеток эмбриональной печени до и после
криоконсервирования определяли по окрашиванию красителем трипановым синим
[186]. Для этого к суспензии добавляли 0.9 % NaCl или сахорозосодержащую
криозащитную среду в соотношении 1:19, а затем инкубировали с 0.4 % раствором
красителя (1:1) в течение 5 мин и подсчитывали долю поврежденных клеток. В
работе использовали суспензию ККЭП, жизнеспособность которой была не менее
60-62 %. Концентрацию клеток определяли в камере Горяева [58].
Цитозоль мягких тканей эмбрионов получали из эмбрионов человека того же срока
гестации, что и ККЭП, как описано [64] и хранили при –35 ?С.
В экспериментах использовали 230 лабораторных белых крыс-самцов массой 150-180
г, содержащихся в стандартных условиях вивария ИПКиК НАНУ. Эксперименты на
животных проводили в соответствии с правилами “Европейской конвенции защиты
позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях”.
Все оперативные вмешательства на животных, включая декапитацию, проводили под
ингаляционным эфирным наркозом.
Перед началом эксперимента ККЭП и ЦТЭ отогревали при 37 єС на водяной бане и
вводили при помощи инсулинового шприца в пульпу селезенки крыс.
В зависимости от поставленных задач формировали следующие модели печеночной
недостаточности у крыс:
1. Частичная гепатэктомия выполнялась по Хиггинсу, Андерсену [144] между 8 и 9
часами утра. Животным вскрывали брюшную полость и удаляли среднюю и левую
латеральные доли печени, которые составляют 68 % массы органа. Введение ККЭП и
ЦТЭ осуществляли сразу после удаления части печени. Животных декапитировали
через 24, 48 и 72 ч после ЧГЭ;
2.Острое токсическое повреждение печени вызывали однократной внутрибрюшинной
инъекцией 40 % - го масляного раствора СCl4 из расчета 0.4 мл на 100 г массы
тела животного. Введение ККЭП и ЦТЭ проводили превентивно за трое суток до
инъекции ССl4. Животных декапитировали через 24, 48 и 72 ч после введения
тетрахлорметана.
3. Хроническое токсическое повреждение печени (экспериментальный цирроз)
вызывали путем внутрибрюшинных инъекций животным 50 % - го масляного раствора
ССl4 из расчета 0.2 мл на 100 г массы тела животного в течение 3-х мес 2 раза в
неделю [73]. Морфологический контроль сформированной экспериментальной модели и
введение ККЭП и ЦТЭ проводили через 10 сут после завершения курса инъекций
ССl4. Животных декапитировали через 14 сут после введения исследуемого
материала.
Независимо от применяемой модели печеночной недостаточности животные были
разделены на 3 группы:
1 группа – контроль: вводили 0.3 мл среды криоконсервирования;
2 группа: вводили суспензию ККЭП (107 клеток/0.3 мл);
3 группа: вводили ЦТЭ (0.7-0.8 мг белка/0.3мл).
2.2. Подготовка биологического материала для анализа
Биохимическому анализу подвергали гомогенаты печени и кровь экспериметальных
животных.
Гомогенаты печени. После декапитации животного печень быстро извлекали и
помещали в охлажденную среду, содержащую 100 мМ трис-НСl буфер, рН 7.4. 1 г
ткани измельчали ножницами, промывали от крови и гомогенизировали
(стекло-тефлон) в 3 мл 100 мМ трис-НСl буфера, рН 7.4. Полученный гомогенат
фильтровали через 2 слоя нейлоновой ткани и хранили на холоду (2-4 єС) до
использования в опыте при определении активности антиоксидантных ферментов,
интенсивности спонтанного ПОЛ и содержания вторичных ТБК – активных продуктов
ПОЛ.
При изучении интенсивности дыхания и окислительного фосфорилирования печень
животного после декапитации перфузировали охлажденным раствором Кребс-Рингера.
1 г охлажденной ткани измельчали и гомогенизировали (стекло-тефлон) в 4 мл
среды, содержащей 0.3 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-НСl буфер, рН 7.4.
Кровь собирали из декапитационной раны в пробирки, обработанные гепарином,
центрифугировали на лабораторной центрифуге (ОПН-ЗУХЛ) при 1500 об/мин в
течение 10 мин. Плазму собирали, а осадок эритроцитов отмывали однократно в 0.9
%-ом NaCl и использовали для получения гемолизата.
Для гистологических исследований ткань печени фиксировали в 10 %-ом формалине,
после чего препараты промывали, обезвоживали в батарее спиртов восходящей
концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. С помощью микротома
МПС-2 приготавливали срезы ткани толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали
гематоксилином и эозином [16].
2.3. Методы исследования
Синтез РНК и ДНК в печени определяли по скорости включения радиоактивных
предшественников нуклеиновых кислот. Животным вводили 3Н-тимидин (0.5 МБк/100г
массы тела животного) и 14С-оротовую кислоту (0.4 МБк/100г). Через час после
вве
- Київ+380960830922