РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для проведения экспериментов было использовано 80 беспородных сытых крыс весом
250-300 г. Исследования проводились в соответствии с правилами «Европейской
конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и
других научных целей» (г. Страсбург, 1985 г.). Все манипуляции с животными
выполняли под наркозом с использованием диэтилового эфира.
2.1. Препаративные методы
Консервирующие растворы и среда нормотермической реперфузии. В работе
использовались две консервирующие среды: UW, упрощенный вариант и ССР,
разработанный в институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины [20].
Состав сред приведен в табл. 2.1 и 2.2. Для выполнения нормотермической
реперфузии изолированной печени использовался раствор Кребс - Рингер
бикарбонатный (табл. 2.3).
Приготовление среды UW. Навески аллопуринола и KOH растворяли приблизительно в
половинном объеме воды, после чего вносили остальные компоненты. pH раствора
доводился после охлаждения раствора до 4°С. Непосредственно перед
использованием среды в нее добавляли восстановленный глутатион.
Таблица 2.1
Состав среды UW
Компоненты раствора
Концентрация, мМ
Лактобионовая кислота
108
KOH
105
NaOH
KH2PO4
2,6
MgSO4
10
Раффиноза
31
Глутатион восстановленный
3,2
Аллопуринол
pH
7,4
Приготовление сахарозо-содержащего раствора. Навески растворяли в охлажденном
до 4 °С 50 мМ буфере Tris-HCl. После доведения pH, в среду вносили 1% БСА V
фракции („Sigma”, США).
Приготовление раствора Кребс-Рингер бикарбонатный.
Навеску буфера “HEPES“ растворяли приблизительно в половинном объеме воды,
после чего в среду вносили остальные компоненты. Перед началом реперфузии среду
нагревали до 37 єС, доводили pH до 7,4, насыщали в течение 5 мин газовой
смесью, состоящей из 95% O2 и 5% CO2 и вносили 1% БСА V фракции.
Таблица 2.2
Состав сахарозо-содержащего раствора
Компоненты раствора
Концентрация, мМ
Сахароза
250
KCl
Na2HPO4
0,5
KH2PO4
0,45
MgSO4
0,5
CaCl2
0,8
рН
7,4
Таблица 2.3
Состав раствора Кребс-Рингер бикарбонатный
Компоненты раствора
Концентрация, мМ
NaCl
120
KCl
4,8
NaHCO3
25
KH2PO4
1,2
MgSO4 Ч 7H2O
1,2
CaCl2
2,6
HEPES
10
Глюкоза
4,5
рН
7,4
Получение изолированной печени крыс и ее гипотермическое хранение. Для изоляции
печени брюшную полость, анестезированного животного вскрывали, в V. cava
вводили гепарин (100 U). В V. porta вводили иглу и начинали перфузию печени
консервирующим раствором (4 oC) со скоростью потока 20-30 мл/мин. Сразу же
после начала перфузии надсекали V. cava inf. и пережимали пинцетом V. cava
sup., чтобы обеспечить отток перфузата из печени. Свидетельством правильного
отмывания органа от крови служило его быстрое и равномерное просветление с
отсутствием мозаичных пятен. Объем консервирующего раствора, которым насыщали
печень, составлял 150 мл. В случае использования раствора UW, печень отмывалась
от крови небольшой порцией (25-40 мл) охлажденного раствора Хэнкса, после чего
орган насыщался консервирующей средой в количестве 100-150 мл.
По окончании перфузии портальную вену надсекали несколькими миллиметрами выше
иглы и вставляли пластиковый катетер диаметром 1,4 мм, который фиксировался
лигатурой. Печень аккуратно извлекали и переносили в пластиковые бюксы,
наполненные соответствующим консервирующим раствором (4 oС) и хранили в бытовом
холодильнике при 4 oС в течение 1 или 24 часов.
Нормотермическая реперфузия. После хранения печень реперфузировали минимальным
бикарбонатным раствором Кребс-Рингер при температуре 37 оС в течение 60 минут в
закрытой перфузионной системе объёмом 250 мл (рис. 2.1).
Перед началом реперфузии на добавочную долю накладывали лигатуру и отрезали для
определения внутриклеточной концентрации АТФ. Скорость потока регулировали в
диапазоне 3-4,5 мл/мг ткани/мин при гидростатическом давлении 30-40 мм вод.
ст.
Рис. 2.1. Аппарат для реперфузии, использующий принцип системы рециркуляции:
Изолированная печень крысы.
катетер.
первичный резервуар.
фильтр.
термостатическая ванна (37°C).
перистальтический насос.
Вторичный резервуар.
Выделение изолированных митохондрий. Митохондрии выделяли при помощи
дифференциального центрифугирования как описано в работе [14] с незначительной
модификацией. Навески печени массой 4-6 г помещали на 5 мин в охлажденную до 0
єС бескалиевую среду выделения. После чего печень продавливали через рычажный
пресс с диаметром отверстий 1 мм. Измельчённая ткань гомогенизировалась с
помощью ручного гомогенизатора Даунса и разводилась в 25-30 раз средой
выделения митохондрий. Гомогенат центрифугировался при 600 g в течение 10 мин
на центрифуге РС-6. Полученный супернатант центрифугировался при 10000 g в
течение 15 мин. Осадок, состоящий из митохондрий, тщательно суспендировался в
среде выделения и повторно центрифугировался при 10000 g. Бескалиевая среда
выделения митохондрий содержала 0,3 M сахарозы и 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-HCl и
приготовлялась путем растворения ЭДТА вместе с Tris. После охлаждения буфера pH
доводили до 7,4 концентрированной HCl . Конечная суспензия митохондрий
содержала 40-50 мг белка/мл.
2.2. Аналитические методы
Определение внутриклеточной концентрации АТФ. Содержание АТФ определяли с
помощью диагностического набора (“Sigma”, США) по методу H. Adams [21].
Для определения 500 мкл 20% гомогената печени приготовленного на Кребс-Рингере
смешивали в центрифужной пробирке с 500 мкл охлажденной 12% ТХУ и оставляли на
льду. Через 5 минут пробу помещали в охлажденные центрифужные пробирки и
осаждали при 3500 об/мин на центрифуге ЦЛН-1 в течение 5 минут. Супернатант
пер