Раздел 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в отделе экспериментальной криомедицины Института проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины (зав. отд. – проф. Б.П. Сандомирский).
Исследования проведены на 210 крысах самцах линии Вистар массой тела 250-300 г
и 189 кроликах породы Шиншилла массой тела 3,0-3,5 кг с нормальной и
патологически измененной печенью (Табл 2.1).
Таблица 2.1.
Характеристика экспериментального материала.
п/п
Методы исследования
термо-метрические
метрические
биомикро-
скопические
флюори-
метрические
гистоло-
гические
гематоло-
гические
биохи-
мические
гемокоагуля-
ционные
Группы
количество животных
1.
Животные
с нормальной печенью
3 х
15 х
20 х
5 хх
13 хх
7 хх
10 хх
2.
Животные
с криовоздействием
на нормальную печень
10 х
10 х
10 хх
20 х
20 х
15 хх
13 хх
7 хх
10 хх
3.
Животные
с цирротически
измененной печенью
3 х
29 х
20 х
10 хх
10 хх
12 хх
10 хх
4.
Животные с криовоздействием на цирротически измененную печень
10 х
10 х
10 хх
20 х
20 х
18 хх
10 хх
12 хх
7 хх
х – крысы; хх – кролики
2.1. Биомикроскопия микрогемоциркуляторного русла печени
Основным методом изучения микрогемоциркуляции была выбрана витальная
микроскопия [89], позволяющая оценить скорость кровотока, диаметр и характер
контуров внутренней и наружной стенок микрососудов, количество функционирующих
микрососудов, взаимодействие форменных элементов крови.
Биомикроскопические исследования проводили на. крысах, наркотизированных путем
внутрибрюшинного введения 20% раствора тиопентала натрия в дозе 100 мг на 100 г
массы тела. Животных помещали на столик, после срединной лапаротомии левую
латеральную долю печени фиксировали на специальной лопаточке, обернутой влажной
марлей. Для поддержания влажности и необходимой температуры, печень в течение
всего эксперимента орошали физиологическим раствором с температурой 39°С. Всю
открытую поверхность печени покрывали влажными марлевыми салфетками. Свободным
оставалось лишь исследуемое поле (рис. 2.1). Изучение состояния
микрогемоциркуляторного русла начинали через
15-20 мин после подготовки животных к опыту, то есть после окончания
манипуляций в брюшной полости и стабилизации микроциркуляции.
Прижизненная микроскопия печени осуществлялась с помощью контактного микроскопа
Люмам К-1, позволяющего проводить исследования в режимах поляризации и
люминесценции.
Поляризационная микроскопия предполагает освещение объекта
линейно-поляризованным светом, который выделяется поляризатором, расположенным
между источником света и конденсором микроскопа. Над объективом помещен второй
поляризатор (анализатор). В этом случае анизотропные участки, имеющиеся в
структуре объекта, выглядят яркими на темном фоне.
Рис. 2.1. Прижизненное исследование микрогемоциркуляции печени крысы с помощью
микроскопа Люмам К-1 и фотометрической насадки ФМЭЛ-1А.
Люминесцентная микроскопия основана на наблюдении флюоресценции объекта,
возникающей под действием возбуждающего ее света. В данном случае люминесценция
была вызвана ультрафиолетовым светом длинноволновой области (350-400 нм),
источником которого служила ртутная лампа. Живые ткани обладают очень слабо
выраженной собственной флюоресценцией, поэтому применяли прижизненное
окрашивание флюорохромами.
Введение флюоресцеина натрия (уранина) и изотиоцианата флюоресцеина (ФИТЦ),
связанного с белками, позволило охарактеризовать состояние кровотока и
транспорт этих веществ в изучаемом органе. Уранин вводился внутривенно в дозе
0,5 мл 2 % раствора крысе массой 250 г. Раствор бычьего глобулина, меченного
ФИТЦ, вводился внутривенно в дозе 1 мл крысе массой 250 г.
В эксперименте применялась готовая сухая люминесцирующая сыворотка,
изготовленная Институтом эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва). Распределение люминесцирующей метки в печени и
интенсивность ее свечения оценивали визуально при микроскопировании или по
фотоснимкам объекта, полученных с помощью фотонасадки МФН-12У 4.2.
Для количественной оценки интенсивности свечения метки в ткани печени
использовали фотометрическую насадку ФМЭЛ-1А, установленную на микроскоп Люмам
К-1 (рис. 2.1). Фотометрическая насадка преобразовывала световой сигнал в
электрический, который измерялся с помощью цифрового вольтметра с регистрацией
на цифропечатающем устройстве. Электрический сигнал пропорционален величине
светового потока, проходящего через диафрагму ФМЭЛ-1 А, что позволило выразить
интенсивность свечения в условных единицах [11, 90].
2.2. Методика получения экспериментального цирроза печени у животных
Экспериментальную патологию печени получали введением четыреххлористого
углерода. Кроликам инъекции 40% масляного раствора ССL4 производили подкожно
два раза в неделю в количестве 0,2 мл раствора на 1 кг массы животного на
протяжении 3-х месяцев [75]. Крысам гепатотропный яд вводился из расчета 0,2 мл
40% раствора ССL4 на 100 г массы животного 2 раза в неделю на протяжении 2
месяцев. При этом падеж кроликов составил 42 %, крыс – 36% от общего количества
экспериментальных животных в группах.
Получение экспериментального цирроза печени у животных контролировалось с
помощью биомикроскопии (рис. 2.2), а также по результатам гистологических и
биохимических исследований.
Рис. 2.2. Микрогемоциркуляторное русло печени крыс в норме (а) и при
экспериментальном циррозе (б).
2.3. Локальное криовоздействие на печень экспериментальных животных
Криовоздействие на нормальную и цирротически измененную печень выполняли с
помощью автономного азотного урологического криоинструмента, изготовленного в
Институте физики НАН У
- Київ+380960830922