РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Получение экспериментального материала
Материалом для исследования служили нативные и криоконсервированные ЭНК
человека I триместра беременности (75 образцов от 25 доноров) и крыс 9-14 суток
гестации (150 образцов от 50 животных).
Эмбрионы человека были получены после письменного соглашения доноров в
результате планового прерывания беременности с помощью специального
приспособления для вакуумэкстракции в стационаре гинекологического отделения.
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с правилами «Европейской
конвенции защиты позвоночных животных, используемых в научных целях». Эмбрионы
крыс были выделены в условиях стерильного бокса как описано [100] .
Извлеченных эмбрионов промывали в стерильном растворе Хенкса и переносили в
чашку Петри для препарации. Затем с помощью пинцета и глазных ножниц извлекали
головной мозг, освобождали его от мезенхимной оболочки и разрезали на небольшие
фрагменты. Для получения суспензии ЭНК извлеченную ткань мозга помещали в
стеклянный гомогенизатор Поттера, добавляли 1 - 3 мл раствора Хенкса без
фенолового красного и пестиком осторожно однократно раздавливали ткань, клетки
смывали со стенок и пестика гомогенизатора небольшим количеством того же
раствора, пропускали через систему игл уменьшающегося диаметра до получения
однородной массы. Время от момента извлечения эмбриона до завершения
приготовления клеточной суспензии не превышало 4-х часов.
Гомогенат мягких оболочек мозга эмбрионов человека 12 недель гестации также
готовили в стерильных условиях. Для этого выделенные оболочки мозга переносили
в стеклянный гомогенизатор Поттера с 0.5-1.0 мл раствора Хенкса и пестиком
осторожно раздавливали фрагменты до получения однородной массы. Полученную
взвесь пропускали через устройство для переливания крови и кровезаменителей
(ПК-11-03), а затем через инъекционные иглы уменьшающегося диаметра [65].
2.2. Методы криоконсервирования ЭНК
На этапе предподготовки ЭНК к замораживанию в качестве криопротекторов
использовали глицерин и ДМСО в концентрации 5%, 7% и 10% каждый. Консервирующие
растворы готовили непосредственно перед работой с клетками на растворе Хенкса
без фенолового красного. Рабочий раствор ДМСО добавляли к суспензии ЭНК при 4°C
через инъекционную иглу по каплям в соотношении 1:1 (по объему) при легком
перемешивании суспензии до получения конечной концентрации криопротектора.
Эквилибрация с криопротекторами проводилась при +4є на протяжении 10 и 20 мин.
С целью оптимизации условий замораживания ЭНК были использованы следующие
криоконсервирующие среды:
№1- солевой раствор Хенкса с добавлением 5% ЭТС
№2- солевой раствор Хенкса с добавлением 10% ЭТС
№3- солевой раствор Хенкса с добавлением 10% ЭТС и глюкозы (600 мг%)
Для сравнения влияния различных скоростей замораживания, были использованы
следующие режимы криоконсервирования:
Режим 1- охлаждение от комнатной температуры до -60°С со скоростью 1 град/мин с
последующим погружением в жидкий азот [219].
Режим 2- охлаждение от комнатной температуры до -25°С со скоростью 20 град/мин,
выдержка в течение 20 минут с последующим погружением в жидкий азот [65].
Режим 3- охлаждение от комнатной температуры до -5°С со скоростью 1-1,5
град/мин, температурная инициация с последующим охлаждением до -60°С со
скоростью 2 град/мин и погружение в жидкий азот [31].
Криоконсервирование ЭНК осуществляли на программном замораживателе «Cryoson»,
(Германия) в полиэтиленовых ампулах («Nunc»), объемом 1мл с добавлением
отобранного на этапе эквилибрации криопротектора (7% ДМSО). Хранение суспензии
ЭНК осуществляли при температуре -196°С в условиях низкотемпературного банка
ИПКиК НАНУ. Отогрев производили на водяной бане при +37°С в течении 45-50 сек.
(до исчезновения твердой фазы), после чего суспензию клеток отмывали от
криопротектора раствором Хенкса, содержащим 20% ЭТС.
Варьирование составом среды замораживания проводили при постоянной медленной
скорости (режим 1), результатом чего был выбор для дальнейших исследований
криоконсервирующего раствора №3. Этот раствор затем использовался в
экспериментах по отработке оптимальной скорости замораживания ЭНК.
В суспензии ЭНК во всех случаях до и после цикла замораживания-отогрева
определяли количество ядерных клеток в камере Горяева [78] и жизнеспособных
клеток с помощью суправитального окрашивания 0,4% раствором трипанового синего
по общепринятым методикам. Для оценки соотношения нейрональных и глиальных
клеток в суспензии ЭНК до и после использовали метод «предплейтинга»,
основанный на различной адгезивной способности глиальных и нейрональных
элементов. При этом глиальные и соединительнотканные клетки, обладающие высокой
адгезивной способностью, прикрепляются к поверхности культурального сосуда, в
то время как нейроны остаются в суспензии [154].
2.3. Методы оценки морфо-функционального потенциала ЭНК
2.3.1. Морфологические методы оценки ЭНК
Изучение морфологического состава клеток производили на мазках-отпечатках,
окрашенных методами общей и специфической окраски. Неспецифическая (общая
окраска) производилась азур-II-эозином по Романовскому. Мазки перед окраской
фиксировали 10 минут в метаноле.
Окраска по Нисслю крезиловым фиолетовым является одним из методов специфической
окраски нервных клеток [20]. Фиксация мазков осуществлялась 96° спиртом в
течение 15 мин. При этом отчетливо определяются конфигурация и размеры тела
нейронов, форма и величина ядра и ядрышка, характер распределения нисслевского
вещества, что позволяет судить о степени зрелости нейронов. При наличии
достаточно зрелых нейронов вокруг ядра выявляются концентр
- Київ+380960830922