ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение спермы петухов
Исследования проведены на сперме петухов породы миноров и австролорпов,
содержавшихся в условиях вивария ИПК и К НАН Украины, а также на петухах и
курах коллекционных пород, имеющихся при НИИ птицеводства УААН (п. Борки).
Сперму получали методом массажа [81,178] в стеклянный спермоприемник,
градуированный по объему. Процедура взятия спермы заключается в следующем:
фиксируют ноги петуха и затем проводят массаж, поглаживая поясничную часть его
спины и живота по направлению к хвосту. Половое возбуждение петуха отмечается
по поднятию хвоста. В этот момент захватывается фаллус и наружу выводят
копуляторный орган. Сперму выдавливают в спермоприемник.
Для исследований использовали смесь эякулятов нескольких петухов (20-30 шт.)
для того, чтобы иметь достаточное количество материала для опытов (объем
эякулята у отдельных петухов варьирует от 0,1 до 0,5 мл), исключить влияние
вариабельности качества отдельных эякулятов на результаты, а также максимально
приблизить полученные данные к практике птицеводства. Известно [78,80], что
после искусственного осеменения кур спермой смешанных эякулятов
оплодотворенность яиц и вывод цыплят повышаются соответственно на 8 и 10 % по
сравнению с использованием несмешанных эякулятов.
Оценка качества спермы
Оценку качества проводили сразу же после ее взятия, при этом учитывались объем
эякулята (мл), активность и концентрация сперматозоидов (млрд/мл). В опытах
использовали сперму петухов, имеющих 90-95 % подвижных и морфологически целых
сперматозоидов.
Для оценки сохранности спермиев в цикле криоконсервирования определяли
подвижность, переживаемость, количество сперматозоидов с целыми мембранами
головок, количество клеток с целыми акросомами и оплодотворяющую способность
сперматозоидов. Концентрацию сперматозоидов определяли в камере Горяева или
спектрофотометрическим методом [124]. Подвижность сперматозоидов оценивали под
микроскопом (х450) в висящей капле на термостолике при температуре 37 0С.
Переживаемость сперматозоидов во времени определяли по подвижности. Абсолютный
показатель переживаемости рассчитывали как площадь фигуры, ограниченной
координатами подвижности спермы, временем ее жизни и кривой падения ее
подвижности [103], по формуле:
S =a1t1 +….an tn, (2.1)
где ап – последовательные оценки подвижности спермы, tn – последовательные
отрезки времени, на которые интерполировалась соответствующая подвижность
спермы. Для определения переживаемости сперматозоидов до и после
криоконсервирования, образцы спермы хранили в холодильной камере криостата
МК-25 при 40С.
Для оценки количества сперматозоидов с целыми и поврежденными мембранами
головок и состояния акросом применяли экспересс-метод, разработанный Сахацким
Н.И.с соавт.[130], используя прижизненное окрашивание клеток флуоресцентными
красителями этидиум бромидом (2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенантридиум бромид) и
тиазиновым красным. Сперму разбавляли в соотношении 1:10 средой, содержащей
тиазиновый красный и этидиум бромид в количестве 0,006 и 0,001 %,
соответственно. Анализ проводили на люминесцентном микроскопе МЛ-3 в отраженном
свете под иммерсией при увеличении 1350. Для возбуждения использовали свет,
сформированный светофильтрами УФС и СС с максимумами пропускания 356 и 400 нм,
а флуоресценцию наблюдали в области 610 нм. При повреждении внешней мембраны
акросомы тиазиновый красный, проникая внутрь, вызывает светло-салатное
свечение. В случае более глубокого повреждения акросомы, которое сопровождается
нарушением ее морфологического строения, тиазиновый красный вызывает
интенсивное красно-коричневое свечение. При повреждениях цитоплазматической
мембраны этидиум бромид проникает в головку сперматозоида и, связываясь с ДНК,
вызывает ярко-малиновое свечение. Таким образом, можно дифференцировать
следующие группы сперматозоидов:
нормальные (несветящиеся темно-синие головка и акросома);
с нормальной головкой (несветящаяся темно-синяя) и поврежденной акросомой
(светло-салатное или красно-коричневое свечение);
с поврежденной мембраной головки (ярко-малиновое свечение) и неповрежденной
акросомой (несветящаяся темно-синяя);
с поврежденной мембраной головки и поврежденной акросомой;
с целой мембраной головки и отсутствием акросомы;
с поврежденной мембраной головки и отсутствием акросомы;
отдельно расположенные друг от друга светящиеся структуры спермиев ( головки с
акросомами или без, хвостики и т.д.).
Для определения оплодотворяющей способности сперматозоидов осеменение кур
размороженной спермой проводили первые два дня подряд, затем один раз в 3-4
дня. Для осеменения кур применяли специальные шприцы с защитным стерильным
чехлом, в который вставляли полиэтиленовую трубку с размороженной спермой.
Осеменение кур криоконсервированной спермой проводили на глубину 2-3 см. Доза
осеменения 0,12 – 0,13 мл, что соответствовало введению 70-90 млн.
сперматозоидов. Сбор яиц начинали через день после второго осеменения. Яйца
инкубировали в инкубаторе «Универсал-55». Оплодотворенность яиц учитывали по
развитию эмбриона после 1-2 суток инкубации путем их вскрытия, или же на 7 день
инкубации при их овоскопировании.
Очистка, идентификация и исследование физико-химических свойств криопротекторов
и их водных растворов
В качестве криопротекторов изучены два гомологических ряда химических
соединений амидов и диолов: формамид (ФА), ацетамид (АЦ), N-метилацетамид
(МАЦ), N,N-диметилформамид (ДМФА), N,N-диметилацетамид (ДМАЦ), ацетилморфолин
(АЦМОР), N-(b-оксиэтил)ацетамид (АЦЭАМ), N,N-(b-диоксиэтил)ацетамид (АЦДЭАМ),
этиленглико
- Київ+380960830922