РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом исследования служили эритроциты донорской крови человека,
заготовленной на среде “Глюгицир”. Выбор криопротектора для криоконсервирования
эритроцитов осуществлялся на основе изучения широкого спектра действия таких
непроникающих криопротекторов, как полиэтиленоксиды м.м. 400, 1500, 2000,
гидроксиэтилкрахмалы, этилированный глицерин, поливинилпирролидоны, которые по
данным различных авторов [106, 124, 125, 151, 255, 297, 402-404] могут
использоваться для криоконсервирования эритроцитов. Проведенные нами
исследования позволили установить, что среди указанных выше непроникающих
криопротекторов наиболее перспективным является ПЭО-1500, обладающий низкой
токсичностью [105] и выраженным защитным действием [106].
В работе был использован полиэтиленоксид м.м. 1500, очищенный для медицинских
целей в ИПКиК НАНУ в отделе криопротекторов, где разработана технология
получения препарата ПЭО-1500 для внутривенного введения [131]. Проведенные
исследования основных физико-химических свойств и показателей токсичности
свидетельствуют, что данный препарат устойчив при хранении и может применяться
в составе криоконсерванта для эритроцитов [131]. Изучение фракционного состава
образцов препарата ПЭО-1500 показало, что в составе полученного олигомера не
содержится низкомолекулярных гомологов с молекулярной массой ниже 400. Основное
содержание представлено фракцией олигомеров с молекулярной массой 1300-1600
[131].
В наших предыдущих работах [8, 19] было установлено, что предварительная
инкубация эритроцитов при 0 0С в гипертонических растворах солей и
неэлектролитов приводит к повышению их устойчивости к последующему сдвигу
температуры (“холодовому шоку”). Это позволило предположить, что
низкотемпературная инкубация эритроцитов с ПЭО-1500 при низких положительных
температурах может сопровождаться сходными изменениями в чувствительности
клеток к охлаждению и замораживанию. В связи с этим в предварительных
экспериментах было исследовано влияние различных температурных режимов (0-4,
10, 15 и 22 0С) инкубации эритроцитов с ПЭО-1500 на устойчивость их к
криоконсервированию. Наиболее существенные различия в уровне гемолиза после
размораживания наблюдались у клеток после инкубации их с ПЭО при 0-4 0С и 22-24
0С. Поэтому в дальнейших экспериментах были использованы эти температурные
режимы. Следует отметить, что температура инкубации 22-24 0С может служить
своеобразным контролем, т.к. во всех существующих в настоящее время методах
криоконсервирования эритроцитов криопротектор добавляется к суспензии клеток
при комнатной температуре (22-24 0С).
2.1 Получение эритроцитов
Для удаления плазмы и лейкоцитов кровь центрифугировали 10 мин при 3000 g.
Осадок эритроцитов трижды отмывали четырехкратным объемом трис-НСl буфера (10
мМ трис-НСl рН 7,4; 150 мМ NaCl), а затем ресуспендировали в равном объеме
физиологического раствора, приготовленного на основе 10 мМ трис-HCl буфера, рН
7,4. Гематокрит определяли в капиллярах на микроцентрифуге МГЦ-8.
2.2 Обработка эритроцитов криопротектором
ПЭО-1500 и замораживание-отогрев
Перед замораживанием эритроциты инкубировали с 30 %-ым раствором криопротектора
ПЭО-1500, приготовленном на основе 10 мМ трис-HCl рН 7,4, содержащего150 мМ
NaCl, который выдерживали при 22 0С 24 ч [141]. Было исследовано два
температурных режима: инкубация при температурах 0-4 и 22-24 0С. Раствор
ПЭО-1500 вводили в клеточную суспензию либо путем добавления равного объема
криопротектора по каплям одномоментно и выдерживали 40 мин, либо путем
добавления через каждые 4 мин по каплям при перемешивании равными порциями в
течении 40 мин (дозированное добавление). При этом соотношение объемов
эритромассы и растворов криопротектора при любом из способов добавления
составляло 1:1.
Взвесь клеток замораживали в стандартных алюминиевых контейнерах ЦНИИГПК. При
работе на микрообъемах для замораживания использовали пластиковые контейнеры
объемом 1 мл. Замораживание осуществляли до температуры –196 0С путем
погружения контейнера в жидкий азот. Оттаивание производили на водяной бане при
температуре 42-44 0С с постоянным покачиванием контейнера.
2.3 Получение “белых теней” эритроцитов
“Белые тени” эритроцитов получали гипотоническим шоком по методу [225], лизируя
клетки при 0 0С раствором следующего состава: 5 мМ Na-фосфатного буфера, pH
8,0; 0,1 М/л фенилметилсульфонилфлуорида (ФМСФ); 0,3 М азида Na. Соотношение
объемов клеточной суспензии и лизирующего раствора составляло 1:30.
Центрифугированием на рефрижераторной центрифуге К-24 мембраны отмывали от
гемоглобина при 12000-15000 g в течение 20 мин. Концентрация белка в белых
тенях эритроцитов находилась в пределах 3-5 мг/мл.
2.4 Исследование взаимодействия 14С-ПЭО-1500
с эритроцитами и “белыми тенями”
В работе использовали 14С-ПЭО-1500, синтезированный в ИПКиК НАН Украины.
Эритроциты и незамкнутые “белые тени” обрабатывали 30%-ым раствором
14С-ПЭО-1500, приготовленным на 10 мМ трис-HCl буфере, содержащем 150 мМ NaCl ,
как указано в разделе 2.2 (в случае обработки клеток брали 200 ml эритромассы).
После инкубации эритроцитов, не связавшийся с клетками криопротектор удаляли
путем трехкратного отмывания его в физиологическом растворе NaCl (к 0,2 мл
клеточной суспензии добавляли 10 мл раствора 150 мМ NaCl) при 22 0С или при 0
0С в зависимости от условий инкубации. После отмывки от криопротектора клетки
лизировали добавлением 200 ml 1% раствора тритона Х-100, а затем отбирали 200
ml и переносили в сцинтилляционную жидкость СЖ-8 для измерения радиоактивности
проб. П
- Київ+380960830922