Ви є тут

Кріоконсервування клітин ембріональної печінки людини у багатокомпонентних кріозахисних середовищах

Автор: 
Петренко Юрій Олександрович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2006
Артикул:
0406U004933
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выделение клеток эмбриональной печени (КЭП) человека.
Фрагменты печени доставлялись в лабораторию из клиник г.Харькова в стерильных
контейнерах на льду в специально разработанной среде для гипотермического
хранения [32]. Источником ткани служили 98 эмбрионов человека 8-12 недель
гестации, полученных после искусственного прерывания беременности с письменного
согласия проинформированных доноров, согласно рекомендациям Хельсинской
декларации Всемирной медицинской ассоциации по проведению биомедицинских
исследований. Фрагменты печени трижды промывали в физиологическом растворе,
содержащим канамицин (100 ед/мл). Суспензию КЭП человека получали в стерильных
условиях неферментативным методом, модифицированным для малых объемов [[cxxi]].
Для этого фрагменты ткани помещали в стерильные пластиковые пробирки, добавляли
1-2 мл солевой среды Дюльбекко (ССД, Sigma, США), и подвергали вибрации с
частотой 50-100 Гц с помощью специального устройства. Полученную таким образом
клеточную суспензию фильтровали через устройства для переливания
кровезаменителей (ПР 2101, Гемопласт) и использовали для дальнейших
исследований либо криоконсервировали.
2.2. Криоконсервирование КЭП человека.
Полученную суспензию клеток разводили ССД до концентрации 2Ч106/мл и переносили
по 0,5 мл в пластиковые криопробирки (Costar, Канада). После чего в
криопробирки по каплям добавляли по 0,5 мл различных криозащитных сред.
Конечная концентрация клеточной суспензии составляла 106/мл. В качестве
криозащитных сред использовали ДМСО и высокомолекулярные соединения: декстран
(Mм=100000), эмбриональную сыворотку (ЭС) крупного рогатого скота, сахарозу или
ПЭО (Mм = 400, 1500, 3500, 8000). Конечная концентрация ДМСО составляла 2%, 5%,
10%, высокомолекулярных соединений - 10%. В некоторых сериях экспериментов
использовали сахарозу в концентрациях 0,05 М, 0,1 М, 0,2 М и 0,3 М или ПЭО-8000
– 1 %, 3 %, 6 %. Суспензию эквилибрировали с криопротекторами при 4°С в течение
15 минут. Программное замораживание проводилипроизводили в поликарбонатном
замораживающем контейнере Nalgene Mr. Frosty (Sigma, США), три этапа: до
температуры -40°С со скоростью 1°/мин, затем до -80°С или с использованием
программного замораживателя ЗП-10 (СКТБ ИПКиК НАН Украины) по аналогичной
программесо скоростью 10°/мин, после чего образцы погружали в жидкий азот.
Суспензии КЭПОбразцы хранили при -196°С не менее 3-х месяцев перед дальнейшими
исследованиями.
Отогрев образцов проводили на водяной бане при 37°С. Аликвоты суспензии (~50
мкл) отбирали для подсчета количества и сохранности клеток. Для удаления
криопротекторов оставшуюся часть суспензии переносили в центрифужную пробирку,
по каплям разводили (1:20) ССД, содержащей 10% ЭС, и центрифугировали при
150-200 g в течение 10 минут. Осадок суспендировали в 1 мл среды. Удаление
криопротекторов проводили при 0єС.
2.3. Определение сохранности и выхода сохранных клеток (ВСК) эмбриональной
печени человека.
Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева согласно стандартным
методикам [30]. Сохранность клеток до и после криоконсервирования определяли по
окрашиванию трипановым синим [[cxxii]].
Сохранность клеток (С) определяли как процентное соотношение живых (не
окрашенных трипановым синим) клеток к общему количеству клеток в камере [30].
,
где:
Ж – количество живых клеток;
К – общее количество клеток.
Для учета потери клеток в процессе криоконсервирования, оценивали разницу между
количеством сохранных клеток до и после криоконсервирования. Выход сохранных
клеток (ВСК) определяли по следующей формуле [54]:
*100%
где:
С0 – сохранность свежевыделенных клеток;
С1 – сохранность КЭП после криоконсервирования;
К0 – концентрация свежевыделенных клеток в 1 мл;
К1 – концентрация КЭП в 1 мл после криоконсервирования.
2.4. Выделение лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека
Различные типы клеток могут отличаться по своей плотности. Это явление дало
основание для разработки способов разделения клеток с использованием
однократного центрифугирования в градиенте плотности. Впервые об использовании
Ficoll для изоляции лимфоцитов периферической крови человека было опубликовано
в 1968 году Boyum и соавт. [[cxxiii]]. В настоящее время, метод разделения
клеток в градиенте плотности Ficoll, схематически приведенный на рис. 2.1,
широко используется для выделения ядерных клеток костного мозга, периферической
и кордовой крови человека.
Рис. 2.1. Схема выделения ядерных клеток периферической крови.
Для выделения ЛПК человека, 4 мл заранее стабилизированной крови разводили 1:1
ССД, после чего наслаивали ее на 4 мл градиента Ficoll-Paque (Pharmacia,
Швеция) и центрифугировали при 800 g в течении 15 минут (рис. 2.1). Обогащённую
суспензию собирали со ступени плотностью с = 1,077 пастеровской пипеткой и
отмывали двукратным центрифугированием в ССД в течение 15 минут при 200 g
[[cxxiv]].
2.5. Восстановление Alamar Blue лимфоцитами периферической крови человека и
клетками эмбриональной печени человека
Alamar Blue (АВ) – нетоксичный редокс-индикатор был успешно использован для
прижизненного определения жизнеспособности и метаболической активности
некоторых типов клеток в условиях культивирования [3, [cxxv], [cxxvi]].
Восстановление Alamar Blue (АВ) ЛПК человека определяли при краткосрочном
культивировании клеток в среде DME/F12 (Dulbecco modified Eagles medium/Ham’s
F12 mixture), дополненной 10% ЭС, 50 ед/мл пенициллина и 50 мг/мл
стрептомицина. Клетки разводили средой культивирования до концентрации 104, 105
или 106 клеток/мл, после чего клеточную суспензию помещали в лунки 96