РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования и его оценка
2.1.1 Получение материала для исследования. Для криоконсервации в закрытых соломинах использовали доимплантационные эмбрионы мыши на стадии поздней морулы или ранней бластоцисты. Эмбрионы получали от самок мышей линии СВА, которых содержали в стандартных условиях вивария. У самок в возрасте 6-8 недель, находящихся в состоянии эструса, индуцировалась суперовуляция введением 5 международных единиц (МЕ) сывороточного гонадотропина жеребых кобыл (ГСЖК) и спустя 46...50 часов 5 МЕ человеческого хориогонического гонадотропина (чХГ) с целью увеличения количества доимплатационных эмбрионов, получаемых от одного животного [164]. Подсадку самцов для осеменения самок проводили сразу после инъекции чХГ. Забой беременных самок проводили дислокацией шейных позвонков. Эмбрионы получали путем промывания препарированных рогов и яйцеводов убитых самок [165, 166] модифицированным фосфатно-солевым буфером Дюльбекко (ФСБ) [167] при комнатной температуре (20?2 ?С). Эмбрионы на стадии поздней морулы или ранней бластоцисты получали через 86-94 часов после инъекции чХГ. После промывания половых путей самок среда исследовалась под микроскопом МБС-9 при 28 кратном увеличении на предмет поиска эмбрионов.
В экспериментах, направленных на определение вида контейнера, позволяющего исключить потери эмбрионов после нагрева, использовали модельный биообъект - ооциты коровы. Ооциты получали из яичников убитых на Харьковском мясокомбинате или на бойне исследовательского хозяйства "Украинка" коров и телок через 30-40 минут после забоя. Сразу после разделки туши животного яичники отсекались и помещались в термос, содержащий ФСБ с температурой 37?2 °С. От момента получения яичников до начала работы с биоматериалом в лаборатории проходило не более 2 часов. Для получения ооцитов яичники иссекались стерильным лезвием путем нанесения параллельных надрезов на расстоянии 0,5 мм друг от друга глубиной 2,0-4,0 мм и промывались ФСБ.
Для апробации разработанного устройства в виде щипцов [168] использовали спермии быка. Сперматозоиды получали от здоровых быков-производителей согласно требованиям Харьковской технологии асептического взятия и разбавляли стандартной лактозно-желточной средой при температуре 20?2 °С [169].
2.1.2. Оценка жизнеспособности биообъектов. Стадию развития эмбрионов мыши, а также их качество, оценивали визуально под бинокулярным микроскопом МБС-9 (при увеличении в 28 раз для изучения общего вида и в 98 раз для исследования отдельных бластомеров) по морфологической целостности зоны пеллюцида и бластомеров [170-172]. При этом исследовали соответствие стадии развития эмбриона его возрасту, определяли геометрические размеры и форму (диаметр зоны пеллюцида и собственно эмбриона, размер бластомеров, толщину зоны пеллюцида, размер периветелинового пространства), учитывали равномерность дробления бластомеров на стадиях развития до компактизации, степень компактизации морулы, симметричность бластоцели бластоцисты. Кроме этого, оценивали состояние цитоплазмы бластомеров зародыша (равномерность распределения веществ, вакуолизация и др.) и целостность зоны пеллюцида и цитоплазматических мембран клеток. В соответствии с состоянием эмбрионы относили к одной из четырех групп: отличного, хорошего, удовлетворительного и неудовлетворительного качества [173]. В экспериментах использовали эмбрионы хорошего и отличного качества [171].
Эмбрионами, выжившими после цикла криоконсервации, считали такие, которые сохранили не менее 50% бластомеров [174-178]. Жизнеспособность деконсервированных эмбрионов оценивали по результатам их развития в среде для культивирования in vitro (ФСБ с применением 20% фетальной сыворотки) до следующей стадии в течение 12-24 часов при температуре 37 ?С [179-180]. Среду для культивирования эмбрионов стерилизовали фильтрованием через миллипоровый фильтр с диаметром 0,22 мкм. Эмбрионы считались жизнеспособными, если при краткосрочном культивировании развивались до следующей стадии.
Качество ооцитов после получения или проведения опыта определяли под микроскопом МБС-9 при 28 кратном увеличении по морфологической целостности. Оценка качества ооцитов заключалась в определении состояния зоны пеллюцида и плазматической мембраны, цвета и прозрачности цитоплазмы. Пригодными и морфологически полноценными считали ооциты пластообразной формы с невредимой прозрачной зоной пеллюцида при отсутствии вакуолизации цитоплазмы и разорванной цитоплазматической мембраны [171]. Признаками дегенерации считали уменьшение размера клеток и неправильную форму.
Подвижность спермиев определяли в раздавленной капле спермы под микроскопом в процентах с помощью общепринятого метода [181]. Для этого на предметное стекло теплой стерильной стеклянной палочкой наносили небольшую каплю спермы к которой добавляли двух-четырехкратное количество 3%-ного раствора цитрата натрия. Сперму с раствором цитрата натрия тщательно перемешивали и накрывали покровным стеклом. Просматривали под микроскопом весь препарат. Подсчет спермиев производили не менее чем в трех полях зрения микроскопа с наибольшей подвижностью спермиев. Подсчитывали количество спермиев с прямолинейным поступательным движением и отдельно - количество спермиев с неправильным движением - манежным (перемещение по кругу), колебательным (спермии не перемещаются, но производят движение головкой или хвостиком) и мертвых спермиев. Расчет подвижности спермиев проводили по формуле:
, (2.1)
где N - показатель подвижности спермиев в пробе, выраженный в процентах;
n1 - число спермиев в пробе с прямолинейным поступательным движением;
10 - постоянный коэффициент;
n - общее число спермиев в пробе.
За окончательный результат принимали среднее арифметическое двух параллельных измерений. Точность данного метода оценки качества спермиев составляет 5%. В экспериментах использовал