РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження
Дослідження проводились в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України .
Експерименти проведені відповідно до «Загальних принципів експериментів на
тваринах», схвалених I Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ,
Україна) і узгодженим з положеннями «Європейської Конвенції про захист
хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових
цілей» (Страсбург, 1985).
2.1. Об’єкти дослідження
Об’єктами дослідження були фрагменти органів статевозрілих свиней та
новонароджених поросят, а також водно-сольові екстракти, які одержували з
кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів. Печінку, селезінку та підшлункову
залозу статевозрілих свиней отримували на Харківському м’ясокомбінаті, а
печінку та підшлункову залозу новонароджених поросят в операційній віварію
ІПКіК НАН України. Поросят доставляли з агрокомбінату Слобожанський
Чугуєвського району Харківської області.
Загальна схема досліджень, проведених в даній роботі, представлена на рис.2.1.
Рис. 2.1. Загальна схема досліджень, проведених в роботі
2.2. Одержання фрагментів органів та їх культивування
Фрагменти печінки отримували шляхом продавлювання її шматочків через решітку з
отворами діаметром 0,8 мм, а фрагменти підшлункової залози та селезінки -
подрібнюючи шматочки органів ножицями. Маса фрагментів становила в середньому 2
– 5 мг. Одержані фрагменти тричі відмивали фізіологічним розчином (рН 7,4) в
співвідношенні 1:10. Для одержання культури тканини підшлункової залози
новонароджених поросят орган асептично видаляли після уведення в паренхіму 2 мл
розчину Хенкса з 10%-ми ембріональної телячої сироватки. Ізольована залоза
подрібнювалась відразу або поміщалася в холодний розчин такого ж складу та
залишалась на строк до 24 годин при 4 – 6 єС. Фрагменти залози культивували в
середовищі такого складу: 80% середовища 199, 10% ембріональної телячої
сироватки, 5% гідролізату лактальбуміна, 5% середовища Ігла, пеніцилін і
стрептоміцин із розрахунку по 100 од/мл.
Культивування проводили в пеніцилінових флаконах об'ємом 30 мл, об'єм рідкої
фази становив 15 мл. В одному флаконі культивували матеріал від однієї залози.
Заміну середовища проводили по мірі його закислення [50].
2.3. Кріоконсервування фрагментів органів
До фрагментів органів по краплях додавали в співвідношенні 1:1 розчин
кріопротектора подвійної концентрації, ретельно і обережно перемішуючи завись.
Кріопротектори, які використовувались в роботі, та деякі фізико-хімічні
характеристики їх розчинів наведені в табл. 2.1 [3, 18].
Завись фрагментів розфасовували в поліетиленові ампули об'ємом 1,5 або 20 мл
при заморожування зі швидкостями охолодження 1, 10 та 100єС/хв. При
заморожуванні зі швидкостями охолодження 1000, 8000 та 80000єС/хв матеріал
поміщали в контейнери з алюмінієвої фольги товщиною 30 мкм. Товщина
заморожуваного шару становила 0,3 мм. Розмір контейнера 40х45 мм.
Таблиця 2.1
Процентні та молярні концентрації розчинів кріопротекторів та температура
кристалізації (о С)
Кріопротектор
Концент-рація в %
Концентра-ція в моль/л
Температура кристалізації, єС
Фізіологічний
розчин без кріопротектора
-0,56
Гліцерин
10
1,086
-2,58
ДМСО
10
0,790
-2,03
20
1,580
-3,50
ПЕО-400
10
0,250
-1,02
20
0,500
-1,50
ПЕО-1500
10
0,066
-0,68
20
0,132
-0,80
Заморожування фрагментів проводили за допомогою програмного заморожувача УОП-6
виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України (швидкості охолодження 1 та 10 єС/хв)
до температури -70єС з наступним перенесенням в рідкий азот, зануренням
поліетиленового контейнера або з алюмінієвої фольги в рідкий азот (швидкості
охолодження 100 та 1000єС/хв відповідно) [52] та за допомогою пристрою для
заморожування біологічних об'єктів (8000 та 80000єС/хв), який дозволяє
отримувати високі швидкості охолодження [262]. Зберігання замороженого
матеріалу проводилося в рідкому азоті.
Відігрів матеріалу проводили на водяній бані з температурою 37 – 40єС. Від
ПЕО-400 та ПЕО-1500 фрагменти відмивали фізіологічним розчином, а від гліцерину
та ДМСО розчином цукрози тієї ж молярної концентрації що і кріопротектор, з
наступною заміною на фізіологічний розчин, розчин Кребса-Рінгера або середовище
культивування.
2.4. Полярографічний метод визначення показників біоенергетики фрагментів
Інтенсивність дихання визначали полярографічним методом за допомогою закритого
платинового електрода Кларка на полярографі фірми Radelkis в нмоль О2/хв/ мг
тканини. В термостабілізовану при 37°С ячейку полярографа, що містила 1 мл
середовища Кребса-Рінгера, додавали 10-20 мг фрагментів і динаміку дихання
реєстрували на самописці. Амітал та ДНФ в ячейку вводили мікрошприцем і їх
кінцева концентрація становила 2 мкмоль/мл і 150-200 мкмоль/мл відповідно
[166].
2.5. Визначення швидкості відновлення фериціаніду калію
Швидкість відновлення фериціаніду калію визначали спектрофотометрично при
довжині хвилі 420 нм. Фрагменти поміщали в середовище Кребса-Рінгера, яке
містило 1 ммоль фериціаніду калію. Після 20 хв інкубації при 370С фрагменти
видаляли і білки осаджували центрифугуванням в присутності трихлороцтової
кислоти і вимірювали оптичну щільність надосаду. По її зменшенню вираховували
швидкість відновлення фериціаніду калію в нмоль/хв/мг тканини [145].
2.6. Одержання екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів
Екстракти одержували з нативних або кріоконсервованих фрагментів органів шляхом
їх інкубації в фізіологічному розчині 30, 60 або 90 хв. Екстракти, які
використовувались д