РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Дослідження виконано в лабораторії репродукції птиці Інституту птахівництва
Української академії аграрних наук на клінічно здорових гусях великої сірої
породи та великої білої популяції. Гусаків (34 голови) утримували індивідуально
у клітках розміром 0,45х0,90 м на підлозі в умовах віварію Інституту
птахівництва, а також в секціях з нормативною щільністю посадки у ДППП
“Роздольне” Зміївського району Харківської області. Підготовку гусей до
репродуктивного періоду проводили згідно методичних рекомендацій [49]. Годівлю
гусей здійснювали за раціонами, розробленими лабораторією фізіології, біохімії
та живлення птиці ІП УААН за загальноприйнятими нормами [50].
Сперму одержували в скляний спермоприймач методом абдомінального масажу [84,
43]. Нативну сперму використовували за схемою проведення досліджень, яку
наведено на рис.2.1. Дослідження проводили на розділених еякулятах.
2.1. Методи визначення морфо-функціонального стану сперматозоїдів гусаків
Під час дослідження фізіологічних показників якості сперми гусаків проводили
облік таких показників, як об’єм еякуляту, рухливість, концентрація, абсолютний
показник виживання сперматозоїдів, та їх морфологічна цілісність.
Для визначення об’єму еякуляту (мл) використовували мірну піпетку або
градуйований спермопроймач [23].
Рухливість сперматозоїдів оцінювали під мікроскопом (ґ450) з термостоликом
(37?С) у висячій краплині загальноприйнятим методом [27; 99] в балах за
десятибальною шкалою, враховуючи кількість статевих клітин з
прямолінійно-поступальним рухом.
Для визначення концентрації сперматозоїдів (млн/мл) користувались камерою
Горяєва [27].
Абсолютний показник виживання сперми визначали за методом [40] у наступній
послідовності. В пластикові пробірки з кожної проби сперми відбирали по 0,5 мл.
Пробірки закривали кришечками і тримали в холодильнику при температурі 4єС.
Оцінку рухливості сперматозоїдів проводили в балах за десятибальною шкалою
через 4, 8, 12 і т.д. годин зберігання, визначаючи активність статевих клітин
під мікроскопом з термостоликом (37?С) у висячій краплині. Тривалість виживання
вимірювали в годинах, тобто визначали кількість годин від початку спостереження
до повної нерухомості сперматозоїдів, але при цьому враховували лише половину
часу між останнім та передостаннім спостереженням, оскільки час повного
припинення поступального руху статевих клітин був невідомий. Абсолютний
показник виживання визначали таким чином: спочатку додавали бали двох сусідніх
оцінок, суму ділили на 2, одержуючи середні оцінки рухливості для кожного
проміжку часу між переглядами. Потім отримані середні оцінки множили на
кількість годин між переглядами, добутки додавали, отримуючи таким чином
значення показника виживання в умовних одиницях.
Для визначення морфологічної цілісності сперматозоїдів методи оцінювання якості
сперми півнів [60] та індиків [4] було модифіковано до роботи зі спермою
гусаків.
Визначення морфологічного стану статевих клітин півнів згідно відомого методу
[60] проводиться з використанням флуориметра. Для оцінки цілісності мембран
сперматозоїдів гусаків його застосовували у наступній послідовності. У
термостатовану кварцеву кювету флуориметра наливали 2 мл тріс-НCl буферу такого
складу (мМ): трісамінооксиметан – 50, хлорид натрію – 120, дистильована вода –
до 100 мл, буфер доводили 0,2н соляною кислотою до рН 7,0. Потім в кювету
додавали 0,02 мл свіжоодержаної сперми гусаків. В якості флуорохрому
застосовували етідіум бромід (2,7-діаміно-10-етил-9-фенілфенантрідіум бромід) в
концентрації 3ґ10-5М. Відомо, що етідіум бромід повільно дифундує через нативні
мембрани та дуже швидко проникає через ушкоджені [76]. Він слабо люмінесцує в
розчині, але всередині клітин при зв’язуванні з молекулами ДНК його свічення
суттєво зростає [77]. Виміри на флуориметрі проводили при збуджуючому світлі
365нм та з реєстрацією люмінесценції близько 610 нм. По калібрувальній кривій
самописця, підключеного до флуориметра, за зафіксованим рівнем люмінесценції
отримували інформацію про кількість сперматозоїдів з пошкодженими мембранами
головок.
Після цього у кювету додавали дігітонін в концентрації 10-4М для пошкодження
мембран головок всіх сперматозоїдів та ще раз визначали люмінесценцію зразка.
По відношенню рівнів люмінесценції до та після введення дігітоніну визначали
кількість (%) морфологічно цілих сперматозоїдів у зразку.
Слід зазначити, що для використання цього відомого методу для оцінки цілісності
мембран статевих клітин гусаків нам необхідно було визначити мінімальний об’єм
зразка та оптимізувати концентрацію етідіум броміду. Досліджувані концентрації
етідіум броміду становили: 3ґ10-8, 3ґ10-7, 3ґ10-6, 3ґ10-4, 3ґ10-3 М. Що
стосується кількості сперматозоїдів гусаків, необхідної для проведення аналізу
одного зразка з використанням флуориметра, було досліджено такі концентрації
статевих клітин: 10ґ106, 20ґ106, 30ґ106, 40ґ106, 50ґ106, 60ґ106 кл/мл.
Для морфологічної оцінки сперми гусаків застосовували ще один відомий метод
[4], який передбачає диференційне фарбування структурних частин сперматозоїдів
сумішшю родаміну С та малахітового зеленого. Для його здійснення до 0,05 М
фосфатного буфера (рН=7,0) додавали родамін С в кількості 0,5% (І-й маточний
розчин) та малахітовий зелений в концентрації 0,5% (ІІ-й маточний розчин).
Безпосередньо перед проведенням аналізу в чистий флакон вносили 1 мл маточного
розчину родаміну С, додавали 1,5 мл маточного розчину малахітового зеленого і
доводили середовищем “Б-26” [1] загальний об’єм барвника до 5 мл. На знежирене
предметне скло наносили краплинку сперми (3-5 мкл), додавали краплю (6
- Київ+380960830922